基于雷公藤配伍前后雷公藤内酯酮含量变化探讨其减毒机制
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摘要：目的 以雷公藤内酯酮为指标，考察黄芪配伍雷公藤前后的雷公藤毒性成分的含量变化，以期推断其可能配伍减毒机制。方法 采用高效液相色谱法比较分析黄芪配伍雷公藤前后毒性成分雷公藤内酯酮含量变化，从化学成分层次分析其减毒的物质基础变化，并结合中药七情中“相畏相杀”理论，推断其可能配伍减毒机制。结果 含量测定试验中黄芪配伍雷公藤的雷公藤内酯酮平均含量（0.42×10-3 mg/mL）明显低于单味雷公藤的雷公藤内酯酮含量（0.54×10-3 mg/mL），说明黄芪配伍雷公藤后降低了雷公藤内酯酮的含量。结论 黄芪与雷公藤配伍可降低雷公藤毒性。
关键词：雷公藤内酯酮；黄芪；高效液相色谱法；相畏相杀
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.023
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）08-0087-04
雷公藤Triptergium wilfordii Hook. f.系卫矛科Celastraceae雷公藤属木质藤本植物，味辛、苦，性寒，归肝、肾经，常作为临床上治疗风湿顽痹之要药。现代药理及临床研究发现，雷公藤具有抗炎、免疫调节等多种生物活性[1-5]，特别是近几年研究发现其具有
抗HIV病毒作用和对阿尔茨海默病的治疗作用[6]，引起药理、毒理及临床学者的关注。但因其有大毒，尤其主要活性成分二萜类（如雷公藤甲素、雷公藤内酯酮）的毒性较强，在很大程度上限制了雷公藤在临床上的应用[7-8]。有学者基于文本挖掘技术探讨雷公藤用药规律，发现雷公藤与黄芪配伍在临床应用中频率最高[9]。本课题组前期毒理学研究显示，雷公藤与黄芪配伍较单味雷公藤毒性明显降低[10]。本研究以雷公藤内酯酮为指标，考察黄芪配伍雷公藤前后的雷公藤毒性成分的含量变化，以期推断其可能的配伍减毒机制[11-12]。
1 仪器与试药
安捷伦1260液相色谱仪（美国Agilent公司），Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），BP211D电子天平（德国赛多利斯），HDM-1000数显控温电热套（江苏省金华市荣坛仪器制造有限公司），HH-4数显恒温水浴锅（江苏省金华市荣坛仪器制造有限公司），HH-S数显恒温水浴锅（巩义市英峪予华仪器厂），RE-85Z旋转蒸发仪（巩义市英峪予华仪器厂），KQ-3200 DB超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），DZF-6020真空干燥箱（巩义市英峪予华仪器厂），SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司），101A-S1型数显电热鼓风干燥箱（上海浦东荣丰科学仪器有限公司），DF-10A摇摆式中药粉碎机（温岭市奥力中药机械有限公司）。
黄芪，合肥天星乐家老铺中药饮片有限公司，批号12072102；雷公藤，合肥天星乐家老铺中药饮片有限公司，批号12072102。所用药材均经安徽中医药大学第一附属医院李立华教授鉴定符合现行药典规定。雷公藤内酯酮对照品，北京盛世康普化工技术研究院，纯度≥98%，批号20130826；甲醇为色谱纯，国药集团化学试剂有限公司，批号20130918；水为屈臣氏蒸馏水，其余试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱：welch material Inc C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流动相：甲醇-水溶液（55∶45）；流速：1.0 mL/min；检测波长：218 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 ?L。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取雷公藤内酯酮对照品适量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.021 5 mg/mL的对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备 雷公藤药材干燥后打成细粉，过40目筛，取药材粉末10 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加75%乙醇回流提取2次，第1次加10倍量乙醇、回流2.0 h，第2次加8倍量乙醇、回流1.5 h，合并醇提液，过滤，回收乙醇。药渣加8倍量水煎煮提取1.5 h，过滤，吸取上清液，同醇提液合并减压浓缩收膏，真空干燥，得干浸膏。将所得的干浸膏置索氏提取器中，加150 mL乙酸乙酯-甲醇（15∶1）于提取器中，于约97 ℃水浴中回流4 h，将回流液挥干部分溶剂，浓缩至约20 mL左右时转移至已用30 mL乙酸乙酯预洗的中性氧化铝（100～200目）的层析柱中，再以80 mL乙酸乙酯洗脱，收集流出液和洗脱液，于水浴锅中蒸除乙酸乙酯，残渣用甲醇超声5 min以上使充分溶解，定容于5 mL容量瓶中，过0.45 ?m微孔滤膜，作为雷公藤供试品溶液。取雷公藤药材10 g、黄芪20 g（均过40目筛），其余供试品溶液提取步骤同上，定容于5 mL容量瓶中，过0.45 ?m微孔滤膜，作为雷黄组供试品溶液。
2.3 专属性试验
按“2.1”项下色谱条件，吸取对照品溶液、雷公藤供试品溶液、雷黄组供试品溶液各10 ?L，分别注入色谱仪，进行测定。对照品及样品色谱图见图1。从色谱图中可以看出，两供试品色谱图中，在与对照品色谱相应的位置上，在相同保留时间有对应的色谱峰。在此色谱条件下，雷公藤内酯酮达到基线分离，样品中其他成分对雷公藤内酯酮的测试无干扰。
2.4 线性关系考察
精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 ?L、按“2.1”项下色谱条件进样测定，以进样量（?g）为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程Y=1958.5X-2.446 7（r=0.999 9），结果表明雷公藤内酯酮进样量在0.043～0.258 ?g范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。
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