外源NO对镉胁迫下蓖麻亚细胞中镉分布及抗氧化酶的影响

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　　摘 要：重金属的亚细胞分布及抗氧化酶系统是植物解毒的重要策略。一氧化氮（NO）是植物组织内重要的信号分子，在植物响应各种逆境条件发挥重要作用。该研究采用水培试验，研究外源NO（SNP）对5 mg・kg-1 Cd胁迫下蓖麻中镉的亚细胞分布及抗氧化酶活性的影响，探讨NO调节下蓖麻对镉的解毒机制。研究表明，与镉处理下相比，100 μmol・L-1 SNP提高了金属解毒组分，降低了金属敏感组分；提高了过氧化氢酶（CAT）活性，不能明显影响超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）的活性变化。因此，NO通过提高金属解毒组分的含量和CAT活性，参与蓖麻对镉的解毒作用。
　　关键词：镉 蓖麻 亚细胞 抗氧化酶 一氧化氮
　　中图分类号：X173 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2015）12（a）-0157-03
　　重金属在植物亚细胞的分布能够反映植物的解毒机理（Wang和Rainbow，2006；Miao和Wang，2007）。采用差速离心法，组织细胞可分为5种亚细胞组分：金属富集颗粒体、细胞碎屑、细胞器、热敏感蛋白和热稳定蛋白（Wallace等，2003）。重金属胁迫下海洋硅藻、无脊椎动物和小麦等生物体的亚细胞区隔化已经开展过研究（Miao和Wang，2006；Wallace等，2003；Li等，2011）。
　　另外，抗氧化酶系统是植物抵抗镉胁迫的一种解毒策略。镉胁迫能够诱导植物体内细胞的氧化胁迫，导致活性氧种类的增加，损害细胞组分（Sandalio等，2001）。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）等抗氧化酶在清除活性氧方面发挥重要的作用，有效抵抗了重金属毒性导致的氧化胁迫（Vanassche和Clijsters，1990；Chaoui等，1997）。而且，抗氧化酶活性水平能够反映生物化学过程并预示金属毒性（Li等，2011）。
　　蓖麻（Ricinus communis L.）是一种重要的能源作物，而且是潜在修复镉污染农田的理想作物（Agarwal，2007；Huang，2011）。研究NO调节下蓖麻对镉的解毒机制非常有意义。一氧化氮（NO）是植物体内一种生物活性分子，通过酶促和非酶促途径产生，能缓解各种环境毒害（王芳等，2013）。
　　目前，关于外源NO（硝普钠作为供体）对镉胁迫下蓖麻中镉的亚细胞分布及抗氧化酶活性影响研究还很少。本研究的目的：（1）探讨外源NO影响下蓖麻中镉的亚细胞分布特征；（2）研究外源NO影响下蓖麻抗氧化酶活性的变化。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验设计
　　该试验为水培试验，在温室进行。温室设定的温度为昼夜25/15 ℃，光强度为300 mE/m2/s，16 h的光周期，平均相对湿度为65%。试验采用50%霍格兰营养液，组分包含2.5 mmol・L-1 KNO3，2.5 mmol・L-1 Ca（NO3）2，0.5 mmol・L-1 MgSO4，0.5 mmol・L-1 KH2PO4，25 μmol・L-1 H3BO3，2.25 μmol・L-1 MnCl2，0.15 μmol・L-1 CuSO4，1.9 μmol・L-1 ZnSO4，0.05 mmol・L-1（NH4）6Mo7O24和5 μmol・L-1 Fe-EDTA。选用的蓖麻品种Zibo-3由山东省淄博市农业科学院提供。蓖麻种子开始播种在无污染的人工土壤上生长2～3周，直到种苗具有两片健壮的叶子。选择长势一致的蓖麻幼苗种植与含有400 mL营养液的1 L盆中。硝普钠（SNP）的水溶液作为NO的供体，CdCl2 2.5 H2O的水溶液作为镉污染来源。试验设3个处理，分别为对照（CK）、5 mg・kg-1 Cd（Cd）、5 mg・kg-1 Cd+100 μmol・L-1 SNP（Cd+SNP），每个处理3个重复，蓖麻叶用于测定生理指标。营养液每三天更换一次，营养液的pH值保持在6.0±0.1。蓖麻幼苗在水培溶液中生长10天。
　　收获的植物鲜叶先用自来水清洗，然后用超纯水清洗3 遍，最后用吸水纸擦拭，保证无水分残留。新鲜叶保存在液氮中，分析抗氧化酶、可溶性蛋白和亚细胞分布。
　　1.2 蓖麻叶中镉的亚细胞分布
　　根据差速离心法（Zhang等，2015），细胞内的镉可分离为5个亚细胞组分：金属富集颗粒体、细胞碎屑、细胞器、热敏感蛋白和热稳定蛋白。5个亚细胞组分的镉质量分数用火焰原子吸收光谱测定（Contra AA 700，Germany）。细胞器和热敏感蛋白组分定义为金属敏感组分，金属富集颗粒体和热稳定蛋白定义为生物解毒组分（Wang和Rainbow，2006）。数据为三个重复的平均值。
　　1.3 抗氧化酶和可溶性蛋白测定
　　新鲜的叶子（0.2 g）经过预冷的研磨器研磨达到均质化，由缓冲液提取。缓冲液的组分为：0.05 mmol・L-1的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠溶解于1%聚乙烯吡咯烷酮，调节 pH值为7.4。均匀的溶浆在10 000 g4 ℃的离心机中离心10 min（Li等，2011）。上清液用于可溶性蛋白和抗氧化酶活性的测定。蓖麻叶中可溶性蛋白的测定采用考马斯亮蓝的方法。可溶性蛋白的含量表示为mg protein・g -1。氮蓝四唑（NBT）光还原法测定超氧化物歧化酶（SOD）的活性（Giannopolitis等，1977）。SOD活性以抑制NBT光还原反应50%所需的酶量为一个酶活性单位，表示为U/mg protein。过氧化氢酶（CAT）依据A240的变化速率计算CAT活性（Aebi，1984），以1 min内A240降低0.1为一个酶活性单位（U），表示为U/mg protein。过氧化物酶（POD）依据A470的变化速率计算POD活性（Chance等，1955），以1 min内A470降低1为一个酶活性单位（U），表示为U/mg protein。 　　1.4 统计分析
　　数据分析采用SPSS 16.0软件（SPSS，Chicago，IL，USA）的方差分析和T检验方法。所用指标采用三个重复。数据表示为平均值±误差，用Duncan’s检验显著性差异（P<0.05）。
　　2 结果与分析
　　2.1 蓖麻不同组织中镉的亚细胞分布
　　以前研究发现，100 μmol・L-1 SNP+5 mg・kg-1Cd处理的生物量相比5 mg・kg-1镉胁迫显著增加，但明显低于对照处理的生物量。另外，相对于镉处理，添加100 μmol・L-1 SNP提高了蓖麻根部和地上部分镉的富集能力。亚细胞中镉的质量分数及相对含量（见表1）所示。相对于镉处理，添加SNP处理细胞器和热敏感蛋白中镉质量分数分别显著降低了65.6%和52.8%。添加SNP增加了生物解毒组分中镉的质量分数和相对含量，降低了金属敏感组分中镉的质量分数和相对含量。
　　2.2 抗氧化酶活性
　　抗氧化酶（SOD、CAT、POD）的活性（见表2）所示。相对于对照处理，5 mg・kg-1镉处理条件下，SOD、CAT和POD的活性显著降低；添加外源SNP后，CAT活性与Cd处理相比显著提高，基本能恢复到对照水平，而SOD和CAT活性与Cd处理相比没显著差异。因此，添加SNP能通过调节CAT活性的方式缓解Cd胁迫下蓖麻叶中的氧化胁迫。
　　3 讨论
　　生物体内金属的亚细胞分布反应了金属富集的内在过程，是一种能够预测金属毒性和耐性的方法（Wallace等，2003）。Wang和Wang（2008）研究认为金属敏感组分能预测硅藻中镉的毒性。Zhang等（2015）研究表明，蓖麻老叶中金属解毒组分或者金属敏感组分和蓖麻对镉的耐性相关联。该研究中SNP提高蓖麻对镉耐性，可能与叶中金属解毒组分增加和金属敏感组分减少有关。
　　抗氧化酶（SOD、CAT和POD）是植物解毒机理的重要组成部分。SOD是一种金属酶类，能够催化超氧自由基转化为过氧化氢和氧气，保护细胞组分免受超氧自由基的毒害（Del Rio等，2002）。CAT和POD是调节细胞内过氧化氢含量的关键酶类（Blokhina等，2003）。研究发现，镉胁迫下植物组织内抗氧化酶活性增加（Yu等，2013）。然而，该研究发现，5 mg・kg-1镉胁迫下蓖麻叶中SOD、CAT和 POD活性显著降低（Table 2）。Zhang等（2015）研究也发现，5 mg・kg-1或2 mg・kg-1镉胁迫下蓖麻叶中SOD、CAT和POD活性降低或无明显变化，与该研究结果相符。外源NO（SNP）能够提高抗氧化酶（SOD、CAT和POD）活性，增强植物对镉的毒害（王芳等，2013）。然而一些研究发现，SNP降低了SOD和POD的活性（朱涵毅等，2013），与该研究结果一致。该研究中SNP提高了蓖麻叶中CAT活性，参与蓖麻对镉的解毒作用。因此，该研究发现，NO通过提高金属解毒组分的含量和CAT活性，参与蓖麻对镉的解毒作用。
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