菘蓝莽草酸羟基肉桂酸酰转移酶IiHCT基因的克隆和表达分析

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　　[摘要] 根据菘蓝转录组数据，克隆了菘蓝莽草酸羟基肉桂酸酰转移酶IiHCT的全长cDNA 并进行生物信息学分析，进一步利用实时荧光定量PCR技术分析了IiHCT基因的表达模式。IiHCT ORF为1 290 bp，编码430个氨基酸，等电点为5.77，相对分子质量为47.68 kDa。IiHCT主要在菘蓝茎中表达，幼根、叶、花蕾中几乎不表达。同时发现离体菘蓝毛状根中可以检测到IiHCT的表达，外源茉莉酸甲酯（MeJA）处理后，IiHCT相对表达量明显增加，在4 h 达到原先的4.3倍。研究首次从菘蓝中克隆得到HCT基因，为进一步解析菘蓝苯丙素类成分的生物合成途径奠定基础。
　　[关键词] 菘蓝；莽草酸羟基肉桂酸酰转移酶；克隆；实时定量PCR；表达分析
　　[Abstract] Based on the transcriptome data，we cloned the open reading frame of IiHCT gene from Isatis indigotica，and then performed bioinformatic analysis of the sequence. Further， we detected expression pattern in specific organs and hairy roots treated methyl jasmonate（MeJA） by RT-PCR. The IiHCT gene contains a 1 290 bp open reading frame（ORF） encoding a polypeptide of 430 amino acids. The predicted isoelectric point（pI） was 5.7，a calculated molecular weight was about 47.68 kDa. IiHCT was mainly expressed in stem and undetectable in young root， leaf and flower bud. After the treatment of MeJA，the relative expression level of IiHCT increased rapidly. The expression level of IiHCT was the highest at 4 h and maintained two fold to control during 24 h. In this study， cloning of IiHCT laid the foundation for illustrating the biosynthesis mechanism of phenylpropanoids in I. indigotica.
　　[Key words] Isatis indigotica； HCT； cloning； Real-time PCR； expression analysis
　　doi：10.4268/cjcmm20152106
　　菘蓝 Isatis indigotica Fort.为十字花科菘蓝属二年生草本植物。根和叶均可入药，分别称为板蓝根和大青叶。板蓝根和大青叶的提取物具有抗多种病毒的活性，但其所含化学成分比较复杂， 目前已经证明具有抗病毒活性的单体（或类组分）仅有表告依春、2，4（1H，3H）-喹唑二酮、4（3H）-喹唑酮、糖蛋白、板蓝根多糖、板蓝根凝集素、直铁线莲宁B等[1-3]。 其中最值得注意的是最近的研究证实直铁线莲宁B具有抑制不同亚型的流感病毒的活性，包括H1N1，H2N3和普通流感病毒等人流感病毒和H6N2，H7N3，H9N2等禽流感病毒[4]，也引起众多菘蓝活性成分生物合成研究者的关注。已有不同的研究组独立完成了菘蓝的转录组测序，并对菘蓝的多个次生代谢途径进行了初步解析[5-7]。
　　直铁线莲宁B合成的前体是松柏醇（coniferyl alcohol），基本途径是先通过苯丙烷途径合成松柏醇，在聚合蛋白酶（dirigent protein， DIR）作用下形成松脂醇（pinoresinol），再在松脂醇还原酶（pinoresinol reductase， PLR）的催化下合成落叶松脂素（lanciresinol）。落叶松脂素都可以在UDP-糖基转移酶的作用下，可以被糖基化转为相应的糖苷，如落叶松脂素可以被转化为落叶松脂素-4，4′-二-O-β-D-二葡萄糖苷即直铁线莲宁B（clemastanin B）。 最近菘蓝苯丙素类成分生源合成途径的主要关键酶基因被陆续克隆[8-9]，为菘蓝苯丙素类的生源合成和调控研究奠定了一定的基础。来源于拟南芥的研究发现，抑制莽草酸羟基肉桂酸酰转移酶（hydroxycinnamoyl-CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyl transferase， HCT）基因可以很大程度抑制p-coumaroyl-CoA向松柏醇（coniferyl alcohol）和芥子醇（sinapyl alcohol）方向转化[10]。而直铁线莲宁B的合成的前体是松柏醇，因此正向调控p-coumaroyl-CoA向松柏醇方向转化可能是提高菘蓝直铁线莲宁B含量的有效途径，目前菘蓝的HCT基因尚未见报道。本研究克隆和分析菘蓝的HCT基因，为后续菘蓝直铁线莲宁B生物合成的定向调控研究提供候选基因。
　　1 材料
　　1.1 植物 菘蓝自交纯系，每年北京郊区秋播。第2年春天收种。在七叶期分别剪取根、地上部分，以及抽薹时的茎和花蕾，液氮速冻，-80 ℃低温冰箱保存，用于提取总RNA。以发根农杆菌C58C1诱导的菘蓝毛状根，1/2MS+3%蔗糖液体培养基暗培养培养（28 ℃，80 r・min-1），每2周继代1次。 　　1.2 试剂及仪器 Plant RNA Reagent购自Life technologies，PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司， KOD plus neo 购自东洋纺（上海）生物科技有限公司，pEASY-Blunt Zero Cloning Kit购自北京全式金生物技术有限公司， SYBR Premix Ex Taq购自TaKaRa宝生物工程（大连） 有限公司，脂糖凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购均购自Axygen公司，茉莉酸甲酯（MeJA）购自Sigma-Aldrich，其他试剂为国产分析纯。本文所用引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。本研究使用的PCR 扩增仪和7500 型实时荧光定量PCR系统均为美国Applied Biosystems 公司。nanodrop 2000紫外分光光度计为Thermo fisher公司产品。
　　2 方法
　　2.1 菘蓝基因组DNA的微量提取 剪取100 mg菘蓝叶片或毛状根，液氮研磨后采用SDS法基因组DNA，RNAseA去除RNA，最后溶于200 μL TE缓冲液（pH 7.4），1%琼脂糖电泳检测完整性。
　　2.2 总RNA 提取 利用Plant RNA Reagent，按照操作说明书，分别提取不同组织和不同处理毛状根的总RNA，通过1%琼脂糖电泳检测RNA的完整性，利用nanodrop 2000紫外分光光度计确定RNA浓度。
　　2.3 全长cDNA 的克隆与测序 采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser先去除DNA，将总RNA 反转录成cDNA，作为Real-time PCR 和后续全长cDNA扩增的模板。利用拟南芥HCT基因蛋白序列信息，在菘蓝的转录组搜索，获得了菘蓝的HCT基因的cDNA全长序列。在此基础上利用Vector NTI 10设计ORF扩增引物（HCT-F： 5′- gagGGATCCatgaaaattaacatccgggat-3′，HCT-R： 5′-gaggtcgacTCATATCTCGTACAAATACTTG -3′）。扩增反应体系：10 μL KOD Buffer（10×），10 μL dNTP（2.0 mol・L-1），6 μL MgSO4，HCT-F和HCT-R（10 μmol・L-1）各1 μL，2 μL cDNA模板，2 μL KOD plus neo DNA Polyerase，32 μL ddH2O。反应程序：94 ℃ 2 min，然后98 ℃ 10 s，56 ℃ 10 s，68 ℃ 1 min 30 s 共34个循环，68 ℃ 7 min。产物利用试剂盒切胶回收后与使用pEASY-Blunt Zero Cloning Kit进行平端连接，转化至试剂盒配套的大肠杆菌Transl-T1感受态细胞中，通过菌落筛选及阳性克隆的初步筛选，并测序验证确定IiHCT全长序列。
　　2.4 IiHCT基因组DNA的克隆 以IiHCT基因cDNA序列搜索菘蓝的基因组序列，发现LiHCT没有内含子，为验证IiHCT是否有内含子，直接利用ORF克隆的引物HCT-F和HCT-R，以菘蓝基因组DNA为模板，扩增IiHCT的基因组序列。扩增反应体系：10 μL KOD Buffer（10×），10 μL dNTP（2.0 mol・L-1），6 μL MgSO4，HCT-F 和 HCT-R（10 μmol・L-1）各1 μL，2 μL基因组模板，2 μL KOD plus neo DNA Polymerase，32 μL ddH2O。反应程序：94 ℃ 2 min，然后98 ℃ 10 s，56 ℃ 10 s，68 ℃ 2 min 共34个循环，68 ℃ 7 min。产物利用试剂盒切胶回收后与使用pEASY-Blunt Zero Cloning Kit进行平端连接，转化至试剂盒配套的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过菌落筛选及阳性克隆的初步筛选，并测序验证确定IiHCT的基因组序列。
　　2.5 菘蓝HCT基因序列的生物信息学分析 全长cDNA序列测序与转录组数据一致，利用Vector NTI 10软件搜索开放阅读框（ORF），翻译成氨基酸序列，并通过BLAST 搜索蛋白质和核苷酸数据库。利用Vector NTI 10软件预测相对分子质量与理论等电点。生物信息学分析利用网上软件包进行完成，如结构域与比对采用Inter-Pro（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan），信号肽分析采用TargetP1.1 server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）进行，蛋白亚细胞定位采用Psort（http：//psort.hgc.jp/）及 olfpsort（http：//wolfpsort.org/），跨膜域分析通过TRMHMM server v2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）进行，predictprotein（http：//www.predictprotein.org/）进行二级结构预测，SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）进行二级结构分析和结构域的三维同源建模。使用DNAMAN 软件对序列进行多重比对，用ClustalW分析软件分别与其他物种的HCT氨基酸序列进行比较，同源比对结果导入MEGA 6.0软件，用于构建系统进化树。 　　2.6 IiHCT基因的表达分析 超净台准确0.5 g菘蓝毛状根，接种到50 mL 1/2MS+3%蔗糖液体培养基，经过28 ℃黑暗条件下摇床培养12 d后，茉莉酸甲酯（MeJA）处理悬浮细胞，使其终浓度为100 μmol・L-1，利用Plant RNA Reagent，按照操作说明书，分别提取提取各个时间点（0，4，8，12，24 h）的总RNA，采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser先去除DNA，将总RNA反转录成cDNA，通过荧光定量PCR检测HCT基因的表达情况。利用Beacon Designer 8.0设计IiHCT实时荧光定量PCR引物（HCTRT-F：5′- CCTACTAATGATGGAAGC-3′，HCTRT-R：5′-TGAATCTGCGACAATAAG-3′），选取菘蓝β-actin作为内参基因，引物为IiActin-F：5′-CCAGTGGTCGTACAACCGGTA-3′和IiActin-R：5′-TAGTTCTTTTCGATGGAGGAGCTG-3′。同时通过荧光定量PCR检测HCT基因在不同组织的表达情况。实时荧光定量反应体系：10 μL SYBR green Mix（2×），0.4 μL ROX Dye Ⅱ（50×），正反引物（5 mmol・L-1）各1.0 μL，0.2 μL cDNA模板，补充ddH2O到20 μL。反应条件为：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s（每次循环后采集荧光信号），40个循环；65～95 ℃做熔解曲线分析。反应结束后分析荧光值变化曲线和熔解曲线。每个反应重复3次，用2-ΔΔCt法分析IiHCT基因的相对表达量。
　　3 结果与分析
　　3.1 菘蓝HCT全长cDNA 和基因组序列的获得 以拟南芥的HCT基因氨基酸序列为种子，利用本地blast的tblastn，搜索菘蓝的转录组，获得IiHCT基因的cDNA全长序列信息，进行全长ORF克隆PCR后，并测序验证后获得了IiHCT的ORF序列。同时扩增获得了与菘蓝HCTcDNA大小相等的片段，测序结果表明IiHCT基因没有内含子（图1）。
　　3.2 IiHCT基因的序列分析 IiHCT基因的全长序列共1 929 bp，Vector NTI结果表明该序列含完整的ORF，含202 bp 5′-UTR和434 bp 3′-UTR，编码1个430个氨基酸的蛋白质。NCBI数据库Blast 比对结果显示HCT氨基酸序列非常保守，与同属十字花科的油菜HCT同源性最高，氨基酸序列一致性达到95%，与拟南芥Arabidopsis thaliana和Camelina sativa一致性分别达到93%，92%。另外与大麻槿Hibiscus cannabinus 84%一致，与陆地棉Gossypium hirsutum L. 83%一致，与Medicago truncatula和药用植物丹参Salvia miltiorrhiza的一致性都为77%。通过InterproScan 进行结构域分析，表明HCT存在2个氯霉素乙酰转移酶类似结构域，属于Transferase蛋白质超家族，与其他多数植物HCT蛋白序列一致性很高（图2），因此，可以推断本实验所获得的cDNA编码的蛋白为HCT，将该基因命名为IiHCT。
　　3.3 IiHCT氨基酸序列的分子系统进化分析 考虑到木质素的合成途径在维管植物中比较普遍，将IiHCT与GenBank中的其他19个物种（包括4个单子叶植物和15个双子叶植物）的HCT蛋白进行比对分析，在软件MEGA 6.0平台上采用相邻连接法构建HCT的系统进化树（图3）。从进化树可见，单子叶植物玉米和水稻与其他双子叶植物距离较大。IiHCT与同属十字花科的油菜、白菜以及拟南芥亲缘关系较近。另外进化树分析显示单子叶植物红的的HCT比双子叶植物进化时间更早。
　　3.4 IiHCT理化性质与3D 结构预测 使用Vector NTI 10软件预测，IiHCT的相对分子质量47.677 kDa，等电点5.77。亚细胞定位进行预测表明，IiHCT可能位于细胞质，跨膜域分析为非膜蛋白。
　　IiHCT 蛋白的二级结构预测结果显示：无规则卷曲、α-螺旋、延伸链是其主要结构原件，无规则卷曲为主占49.77%，其次α-螺旋结构为占26.98%，延伸链占23.26%。三维同源模型图所示，IiHCT基因预测的编码蛋白质二级结构与三级结构预测结果相符合，IiHCT三维同源模型以4g22.2.A蛋白为模板，用于建立该模型的氨基酸残基范围为1～430位，序列同源性为78.6%（图4）。
　　3.5 IiHCT的组织特异性和受MeJA诱导的表达分析 通过实时荧光定量PCR 手段，采用2-ΔΔCt方法对不同组织、MeJA处理后不同时间点的毛状根进行了IiHCT基因相对定量表达分析（图5）。实验发现，IiHCT主要在茎中表达，在幼根、叶、花蕾中几乎不表达，但在离体毛状根中有表达。MeJA处理能明显促进毛状根中IiHCT基因的转录。4 h时IiHCT达到原来的4.3倍，之后的8，12，24 h表达一直维持在2倍以上水平。
　　4 讨论
　　本研究根据菘蓝的转录组信息，从菘蓝中克隆苯丙素类成分合成途径的又一个关键酶HCT基因，并对该基因基因的核酸序列及其推测的蛋白序列组成进行了生物信息学分析，结果表明，该基因与其他植物的HCT 基因特别是同属十字花科的油菜HCT有很高的相似性，命名为IiHCT。本研究获得含有完整HCT基因的完整ORF，其编码的氨基酸蛋白具有两个典型的氯霉素乙酰转移酶类似结构域，属于Transferase蛋白质超家族结构域，这些结构域在发挥功能时不可或缺，因此克隆得到的IiHCT将成为Transferase超级家族新成员。 　　Real-time PCR表达分析发现，IiHCT基因主要在茎中表达，在幼根、叶和花芽基本检测不到其表达。但是菘蓝的苯丙素类有效成分如直铁线莲宁B的主要积累部位在根部，但IiHCT在幼根表达水平很低，提示木质素合成比较旺盛的茎和根可能也是菘蓝苯丙素类有效成分如直铁线莲宁B的积累的主要部位。毛状根体系是药用植物研究中的常用体系，有趣的是，在离体的毛状根体系中检测到了很高水平的IiHCT表达。另外本研究还发现预培养12 d的菘蓝毛状根，用100 μmol・L-1 MeJA处理后，IiHCT的转录水平在4 h达到原来的4.3倍，24 h内一直维持2倍以上的水平。前人的研究也发现MeJA处理后，其他该途径的基因也会上调[5]，因此通过正向调控IiHCT基因在内的关键酶基因可能是提高菘蓝毛状根体系苯丙素类成分生物合成的有效途径。另外，已有报道发现在同属十字花科的拟南芥中，抑制HCT基因几乎可以导致H型木质素单体在3种单体木质素占据接近100%，而H型木质素和菘蓝中苯丙素类有效成分如直铁线莲宁B的前体都是松柏醇，所以正向调控HCT基因可能是通过代谢流导向提高菘蓝毛状根中苯丙素类有效成分生物合成的关键步骤之一。当然，菘蓝苯丙素类有效成分的生物合成与调控一个非常复杂的工程，IiHCT基因具体的功能以及其菘蓝苯丙素类有效成分生成的调控机制仍有待阐明。IiHCT基因的克隆为蛋白异源表达及在毛状根体系里研究和验证其功能提供了基础，也为进一步通过代谢流导向提高菘蓝中苯丙素类有效成分的生物合成提供了理想的候选基因。
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　　[责任编辑 吕冬梅]
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