白木香肉桂酸―4―羟基化酶（C4H）基因的克隆及表达分析

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　　[收稿日期] 2013-10-28
　　[基金项目] 国家自然科学基金项目（31000136， 81173481）；北京市自然科学基金项目（6102024）；教育部新世纪优秀人才支持计划项目（2008）；高等学校博士学科点专项科研基金项目（20091106120009）；国家“十二五”科技支撑计划项目（2011BAI01B07）；海南省中药现代化专项项目（2010ZY001， 2012ZY002）；海南省重大科技研发专项（ZDZX20100006）
　　[通信作者] *张争，Tel：（010）57833363， E-mail：zhangzheng321@126.com；*郭庆梅，教授，博士生导师，Tel：18615187362，E-mail：qmguo@sina.com
　　[作者简介] 梁良，Tel：（010）57833363，E-mail：liangliang0118ll@126.com
　　[摘要] 对国产沉香的基原植物白木香Aquilaria sinensis肉桂酸-4-羟基化酶基因C4H编码区进行克隆，并对其进行生物信息学分析和表达分析。根据已报道的白木香伤害转录组高通量测序结果分析获得1条具有肉桂酸羟化酶酶保守结构域的C4H基因序列，采用RT-PCR技术克隆得到白木香C4H基因编码区序列，并对C4H蛋白进行生物信息学分析。另外，采用qRT-PCR方法对C4H基因在伤害胁迫下的表达模式进行分析。序列分析表明，所克隆的C4H基因编码区开放阅读框（opening reading frame，ORF）长为1 515 bp，编码514个氨基酸，GenBank登录号为KF134783。qRT-PCR实验证明C4H基因受不同伤害处理的诱导，分别在8，20 h达到最高表达水平。白木香C4H基因的编码区序列的分离克隆为进一步研究C4H蛋白在白木香中黄酮及芳香族类化合物合成途径中的功能及表达调控奠定基础。
　　[关键词] C4H酶； 白木香； 芳香族化合物； 伤害
　　国产沉香为瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis（ Lour. ） Gilg 含树脂的木材。作为我国传统中药，沉香有具行气止痛、温中止呕、纳气平喘的功效，用于胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气逆喘急[1]。沉香只有在健康白木香树受到外界伤害后才能形成[2]。但是，伤害诱导沉香形成的分子机制一直未得到清晰揭示， 制约了高效结香技术的建立。沉香的化学成分主要为：倍半萜类、芳香族类成分和2-（2-苯乙基）色酮[3-4]。合成芳香族化合物的苯丙烷途径的关键酶之一是肉桂酸-4-羟基化酶 [5]。研究表明，C4H在转录水平上的丰度和蛋白质水平上的活性能有效影响植物中芳香族化合物和黄酮类化合物的生物合成量[6-8]。本实验根据已知的植物C4H的氨基酸序列进行同源序列比对，设计引物，应用RT-PCR从白木香中克隆C4H基因全长并进行序列分析，了解白木香C4H基因的结构与功能，这对从分子水平上探讨白木香苯丙烷类次生代谢途径具有重要意义。
　　1 材料
　　中国医学科学院药用植物研究所温室栽培的3年生白木香茎诱导产生的愈伤分别进行机械伤害（用灭菌后的刀片切割至体积约为5 mm3的小块）和100 μmol・L-1 MeJA（茉莉酸甲酯）处理，于处理后2，4，8，12，16，20，24 h取样，用于提取总RNA，检测C4H基因在健康和伤害后愈伤组织中的表达差异。
　　2 方法
　　2.1 总RNA提取
　　按照EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒（Aidlab，中国）实验操作步骤进行RNA制备，制备好的总RNA最终溶解于30 μL RNase free水中， 1% 琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，分光光度计NanoDrop 2000C （Thermo Scientific， 美国） 测定RNA浓度。
　　2.2 cDNA第一链的合成
　　利用TaKaRa公司的M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit 试剂盒将白木香总RNA反转录为第一链互补链DNA （ cDNA）。反转录的反应条件及程序均按照TaKaRa公司的M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit 试剂盒说明书进行。
　　2.3 C4H基因的克隆
　　从白木香转录组高通量测序[9]结果中获得1个由表达序列标签拼接而成的序列，经注释分析发现此片段是具有完整开放阅读框的C4H基因，其开放阅读框为1 515 bp，定名为C4H。
　　根据GenBank （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中报道的植物C4H基因同源性较高的核苷酸序列，设计保守区简并引物C4H-F：CTTCTTCCCGACACAAAATATCT 和C4H-R：CCCAAAACAGTACATTGGACAG。以白木香总RNA的反转录产物为模板，按照下列体系进行扩增：cDNA 3 μL，10×Pfu buffer 5 μL，dNTP （2.5 mmol・L-1） 4 μL，Taq Plus（2.5 U・μL-1） 1 μL，10 μmol 引物各1 μL，终体积为50 μL。反应程序95 ℃ 5 min；70 ℃ 60 s；48 ℃ 60 s；72 ℃ 2 min；30个循环；循环结束后72 ℃延伸反应5 min；4 ℃保存。经1% 琼脂糖凝胶电泳检测后，将回收的目的片段回收与pGM-T载体连接，经热激法转化到大肠杆菌TOP 10中，用蓝白斑筛选重组子，挑选阳性克隆的单菌落37 ℃培养12～16 h，经菌液验证后选择扩增出与目的片段一致的条带的克隆（2个）送上海英潍捷基生物技术公司（北京测序部）进行测序。 　　2.4 C4H的生物信息学分析
　　2.4.1 C4H蛋白的理化特性分析 基因编码蛋白的理化性质预测采用ExPASy Proteomics Server 提供的在线工具Protparam （http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html） [10]。
　　2.4.2 C4H跨膜区及三维结构预测 采用TMHMM 2.0进行跨膜结构域预测； 采用SWISS-MODEL （http：//swissmodel.expasy.org/） 进行蛋白质二级结构分析；采用Phyre（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre）进行结构域的三维建模[11-12]。
　　2.4.3 进化树分析 将C4H翻译的氨基酸序列与NCBI 数据库中的C4H氨基酸序列在线BLAST比对， 通过MEGA4软件构建Neighbor-joining系统进化树。进化距离的计算采用泊松校正法，Bootstrap重复次数为1 000次[13]。
　　2.5 白木香C4H基因在不同伤害处理时间的表达分析
　　实时荧光定量PCR （real-time PCR） 为了明确C4H 基因在不同组织及不同伤害处理下的表达特性， 利用荧光定量PCR进行表达量的检测。检测白木香愈伤组织中C4H基因在其不同伤害处理及不同处理时间的表达情况。仪器采用伯乐的CFX96TM C1000 实时PCR检测系统。反应体系为：2×SYBR Premix Ex TaqTM 5 Μl；正反向引物浓度均为0.25 μL； cDNA 模板0.3 μL； 加水补足至10 μL， 每个反应体系至少重复3次。实时PCR 扩增程序如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；60 ℃ 20 s，40个循环。实时PCR反应均以三磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPDH）为内参[14-15]。
　　3 结果与分析
　　3.1 白木香C4H基因的克隆
　　根据高通量测序结果，以白木香的cDNA为模板，利用PCR方法扩增获得1个1 515 bp的基因序列，编码504个氨基酸，GenBank 登陆号KF134783。白木香C4H 基因PCR扩增结果见图1。基因命名为C4H，将其连接pGM-T 载体转化到大肠杆菌TOP10，测序结果经NCBI的Blast比对，确定其扩增产物为白木香C4H基因cDNA的片段。
　　M.DL2000 DNA marker； 1.PCR 产物。
　　图1 白木香C4H基因的克隆
　　Fig.1 Cloning of C4H from Aquilaria sinensis
　　3.2 C4H的生物信息学分析
　　3.2.1 C4H蛋白的理化特性分析 利用ExPASy Proteomics Server 的在线软件Protparam （http：//www.cn.expasy.org/tools/protparam.html） 对C4H蛋白的理化性质进行预测分析。推测其分子式为C2616H4140N722O725S16，相对分子质量 57.819 01 kDa，等电点pI 8.78。带正电残基（Arg+Lys） 65，负电残基（Asp+Glu） 60。该蛋白的不稳定系数为50.98，脂肪系数为99.78，亲水性系数为-0.184。
　　3.2.2 C4H跨膜区及三维结构预测 用TMHMM2.0预测C4H跨膜区域。蛋白含有2个跨膜螺旋结构，分别位于9～27位和445～463位氨基酸之间。由分析软件建立的C4H三维结构模型见图2。
　　图2 C4H蛋白的三级结构预测
　　Fig. 2 The 3 dimension structure of C4H
　　3.2.3 C4H氨基酸序列的分子系统进化分析 利用NCBI在线BLAST工具，将C4H与GenBank中18种植物的C4H蛋白进行比对，C4H蛋白与榄树、黄瓜等植物的C4H蛋白相似性达90%。通过MEGA 4软件采用相邻连接法构建C4H进化树，进行聚类关系分析，见图3。
　　3.3 白木香C4H基因在不同伤害处理时间的表达分析
　　健康的白木香只有受到外界伤害后才能产生沉香类物质。研究表明，机械伤害和化学刺激都能够诱导相关物质的产生[3-4]。为了研究C4H基因的表达是否受这些因素的调节，本实验采用荧光定量PCR的方法对C4H在不同处理下不同时间点的表达量进行了分析，见图4。本研究采用qRT-PCR分别检测未处理组对照组、机械伤害及100 μmol・L-1 MeJA分别处理（2，4，8，12，16，20，24 h）后C4H基因的表达情况，结果显示C4H基因在新鲜愈伤组织中表达量较低，在MeJA处理下，C4H基因的表达缓慢升高，20 h时达到最高表达水平，而后缓慢下降，但仍然高于健康中的表达水平；机械伤害对C4H基因的诱导强度明显强于MeJA处理，表达在8 h时到最大，然后急剧下降。
　　C4H序列来自GenBank数据库；图中数字为自举检验置信值（1 000个重复）。
　　图3 植物C4H氨基酸序列系统进化树
　　Fig.3 Phylogenetic analysis of C4H amino acid sequence
　　图4 机械伤害和MeJA处理后C4H的表达情况
　　Fig.4 Expression profile of C4H after mechanical and MeJA wounds
　　4 讨论
　　肉桂酸-4-羟基化酶（C4H）是植物苯丙烷代谢通路中的第2个酶，该酶在植物细胞中的含量可以影响黄酮、木质素及芳香族类物质的合成等多条代谢支路[16]。逆境胁迫下，植物可通过调节一系列合成相关酶基因的转录水平从而影响其黄酮类和芳香族类的合成和积累[13]，其中就包括C4H。Ryan等[7]在矮牵牛花中的研究发现，UV-B胁迫处理下，C4H 等基因表达量的增加使得植物组织中总黄酮含量增加。Baek等[17]在黑莓中发现，黄酮积累量与C4H表达量在果实发育的不同时期表现了同步增加或减少的变化趋势。Liu等[18]发现K离子缺乏诱导的菊花中C4H等基因的表达量减少，造成了该部位黄酮含量的降低。植物中有多个参与苯丙烷类代谢途径的P450酶类，其中C4H作为苯丙烷类代谢途径的第1个P450，其一级结构中与肉桂酸结合的特异氨基酸残基以及高级结构（二级结构和三级结构）所形成的活性中心口袋[19]，使其在结构和功能上与其他P450区别开来[13]。此外，植物黄酮的生物合成一般定位于内质网外膜上，由一系列特定的黄酮合成相关酶组成的多酶复合体连续合成并转运到特定的亚细胞结构中[20]。C4H的N-末端的膜锚定信号基（signal-anchor sequence），使其定位于内质网外膜上，参与苯丙烷类代谢途径中多酶复合体的亚细胞定位和内质网上电子链的化学传递[21]。 　　芳香族化合物是沉香药材的重要有效成分之一[22-23]，解析其生物合成途径是阐明结香机制和建立高效结香技术体系的分子基础。高通量测序技术是非模式药用植物基因挖掘的有效手段，课题组前期对白木香进行了转录组分析，从中得到大量关键合成酶基因片段[3，9]。本研究根据测序得到的C4H基因的转录本信息，成功从白木香中克隆了一个C4H基因的全长cDNA并对其进行生物信息学分析。结果表明，C4H和其他植物中已经鉴定的C4H具有较高的同源性及相类似的理化特性， 说明本研究克隆的C4H属于C4H基因家族。健康的白木香不能产生沉香， 只有受到伤害后才能被诱导产生，用典型的机械伤害及MeJA处理2种方法处理健康的愈伤组织，检测C4H基因的表达，发现C4H 基因显著受这2种伤害的诱导，该结果初步揭示了C4H基因在沉香形成中的可能作用。
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