2-乙酰基-5-甲氧基苯基-2-[4-(1-氧代-2-异二氢吲哚基)苯基]丁酸酯抗血栓作用实验研究

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　　摘要 目的：观察2-乙酰基-5-甲氧基苯基-2-[4-（1-氧代-2-异二氢吲哚基）苯基]丁酸酯（AMEB）对血栓形成的影响及其初步安全性评价。方法：采用体外抗血小板聚集、大鼠动静脉旁路血栓模型、小鼠急性毒性实验和小鼠胃黏膜损伤实验观察AMEB的作用和安全性。结果：AMEB可显著抑制AA和ADP诱导的体外血小板聚集，IC50分别为1.10mmol/L和0.59mmol/L，口服给药12、24mg/kg可显著抑制大鼠动静脉旁路血栓形成，初步安全性评价显示口服2000mg/kg仍未出现动物死亡，而对小鼠胃黏膜损伤强度显著低于阿司匹林。结论：AME具有明显的抗血小板聚集和抑制血栓形成作用，且安全性较好。
　　关键词：AMEB；抗血栓；抗血小板聚集；安全性
　　
　　丹皮酚是中药活性成分，药理活性广泛，具有抑制主动脉平滑肌细胞的增殖及抗自由基作用，并通过抗血小板抑制粥样硬化斑块形成[1]。吲哚布芬属环氧化酶抑制剂，具有显著抗血小板聚集和抑制血栓生成作用[2]。2-乙酰基-5-甲氧基苯基-2-[4-（1-氧代-2-异二氢吲哚基）苯基]丁酸酯（AMEB）为运用现代药物化学原理对中药活性小分子和优效基团结构改造合成的全新化合物。
　　
　　C27H25NO5，443.17
　　本研究通过体外抗血小板聚集实验和大鼠动静脉旁路模型观察AMEB对血栓形成的影响，利用小鼠急性毒性实验和小鼠胃黏膜损伤实验初步评价其安全性，为AMEB进一步开发提供依据。
　　1 实验材料
　　1.1 试验动物
　　雄性SD大鼠50只，体重250~300g，上海杰思捷实验动物有限公司提供，动物合格证号SCXK（沪）2012-0006；雄性ICR小鼠60只，体重18~22g，南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，动物合格证号SCXK（苏）2012-0004；家兔两只，体重1.8~2.2kg，南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，合格证号为SCXK（苏）2012-0008。
　　1.2 试验药品
　　AMEB、吲哚布芬，由安徽中医药大学药学院提供；阿司匹林肠溶片，江苏平光制药有限责任公司，批号20120523。
　　1.3仪器试剂
　　SC2000血小板聚集仪，北京赛科希德科技发展有限公司；JA3003电子天平，上海精科天平仪器厂；荧光显微镜，蔡司光学仪器国际贸易有限公司；腺苷二磷酸二钠盐（ADP），Amresco，批号201005，酸溶性；花生四烯酸（AA），Sigma，批号125K2600。
　　2 实验分组及给药
　　2.1大鼠动静脉血栓实验
　　50只SD大鼠随机分为：空白组、AMEB低、中、高剂量组和吲哚布芬阳性对照组，每组10只，连续给药5天，每天灌胃给药一次，给药容积均为0.2ml/100g体重。
　　2.2小鼠急性毒性实验
　　30只小鼠单次灌胃给药，给药容积为0.2ml/10g；
　　2.3 小鼠胃黏膜损伤实验
　　30只小鼠分为空白组、阿司匹林和AMEB各200mg/kg，单次灌胃给药，给药容积为0.2ml/10g。
　　3 实验方法
　　3.1体外血小板聚集测定[3]
　　雄性家兔两只，利多卡因局部麻醉，颈动脉插管放血，与0.38g枸橼酸钠与10ml生理盐水配制成3.8%的枸橼酸钠溶液以9:1混合，800r/min离心10min，取富血小板血浆（PRP），剩余部分以3000r/min离心，取贫血小板血浆（PPP）。诱导剂用10μg/ml ADP、200μg/ml AA，每管180μl PRP中加入不同浓度的药物10ul，对照组PRP中加入生理盐水10ul，温育3min，然后加入上述诱导剂，检测血小板聚集率，重复6次取平均值。血小板聚集抑制率（%）=（对照组最大聚集率－给药组最大聚集率）/对照组最大聚集率×100%。
　　3.2大鼠动静脉旁路模型
　　参照文献[4]方法，末次给药30min后，10% 水合氯醛腹腔麻醉（1ml/100g体重），仰卧固定分离右颈总动脉及左颈外静脉。取内径为1.5mm、长10cm聚乙烯管，内置一根长6cm的丝线（预先称重），以肝素生理盐水溶液（50U/ml）充满聚乙烯管。将聚乙烯管的一端插入左颈外静脉后，注入肝素（50U/kg），另一端插入右颈总动脉。开放血流15min后中断血流并迅速取出丝线称重，总重减去原丝线重即为血栓湿重，计算抑制率。抑制率（%）=（正常对照组血栓湿重－给药组血栓湿重）/正常对照组血栓湿重×100%。
　　3.3 小鼠急性毒性实验
　　采用小鼠单次灌胃给药法探讨AMEB对小鼠的急性毒性，初步评价实验动物中毒的表现及相应数据，为其进一步药理药效实验提供依据。
　　3.4 小鼠胃黏膜损伤实验[5]
　　灌胃4h后，以10%水合氯醛3ml/kg行静脉注射麻醉处死大鼠，取胃组织，保存待用。胃黏膜损伤指数按Guth标准计算：斑点样损伤为1分，损伤直径（长度）<1 mm为2分，损伤直径1~2 mm为3分，损伤直径2~4 mm为4分，损伤直径>4 mm为5分，如损伤宽度>2 mm，损伤积分值乘以2。
　　4 统计学分析
　　实验数据使用SPSS 19.0统计软件进行分析，实验数据以均值±标准差（±s） 表示，用方差分析检验进行统计分析。
　　5实验结果
　　5.1体外血小板聚集测定结果
　　对AA（200μg/ml）诱导的血小板聚集，AMEB抑制IC50为1.10mmol/L；对ADP（10μg/ml）诱导的血小板聚集，AMEB抑制IC50为0.59mmol/L。吲哚布芬IC50值分别为0.93mmol/L和0.62mmol/L。
　　5.2对血栓湿重的影响
　　AMEB 12、24mg/kg剂量组及阳性组与空白相比，血栓湿重有极显著性降低（P<0.01），提示AMEB能显著抑制血栓形成，与吲哚布芬相比有优势，见表1。
　　表1AMEB对血栓湿重的影响（n = 10，±s）
　　组别 剂量（mg/kg） 血栓湿重（mg） 抑制率（%）
　　空白组 - 84.75±10.22 -
　　阳性组 12 62.63±15.94** 26.11
　　AMEB组 6 74.63±10.91 11.95
　　 12 60.88±10.56** 28.17
　　 24 55.54±8.85** 34.47
　　注：与空白组比较，**P<0.01。
　　5.3小鼠急性毒性实验结果
　　AMEB单次灌胃给药2000mg/kg，观察15min未见小鼠死亡，小鼠行为及运动状态未见中毒表现，病理解剖未见胃黏膜异常，毒性较低。
　　5.4 小鼠胃黏膜损伤结果
　　阿司匹林组有严重胃肠道出血和糜烂副作用，AMEB组仅有轻微胃黏膜损伤，有显著性差异（P<0.01），提示AMEB胃肠道刺激较小，见表2。
　　 表2 小鼠灌胃给药后胃黏膜损伤指数（±s）
　　组别 剂量（mg/kg） 胃黏膜损伤指数
　　空白组 - -
　　阿司匹林组 200 34.5±5.1
　　AMEB组 200 2.8±0.8**
　　注：与阿司匹林组比较，**P<0.01。
　　6 讨论
　　血栓形成是导致心、脑和外周血管事件的最后关键环节，是致死和致残的直接原因，如动脉粥样硬化基础上形成的动脉、静脉血栓引起的组织缺血和（或）坏死。血栓栓塞性疾病可累及全身各个器官及系统，发病率、致死率和死亡率都很高，阿司匹林、肝素等药物出现，抗栓治疗发生巨大变化[6]，随着对血栓形成机制的不断深入了解，新抗血栓药物的出现对血栓病的防治起到积极作用[7,8]。由于血小板在血栓形成与止血过程中起重要作用，抗血小板聚集药物通过抑制血小板的黏附、聚集和释放功能，阻止血栓形成[9]，成为新药开发的热点。
　　AMEB为全新结构化合物，理论上具备丹皮酚和吲哚布芬的双重作用效果，本文研究首先证明其具有显著的抗血小板聚集、抗血栓形成作用，且药效较对照药有一定优势，初步安全性评价显示毒性较小，胃肠道刺激显著弱于阿司匹林，具备进一步开发为临床药物的潜力。
　　
　　参考文献
　　[1]周晓霞,周晓慧,许倩,等.丹皮酚对高脂血症所致大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的抑制作用[J].河北中医,2000,22(6):477- 4781.
　　[2]Wiseman LR,Fitton A,Buckley MM.Indobufen.A review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and therapeutic efficacy in cerebral, peripheral and coronary vascular disease[J].Drugs.1992 ;44(3):445-464.
　　[3]朱敏恒,吴越,陈虹,等.烟酰水杨酸对Collagen、ADP、AA诱导的血小板聚集的影响[J].中国药理学通报,2005,21(10):1232-1234.
　　[4]衡亮,宦梦蕾.银杏叶提取物抗实验性血栓模型大鼠的作用及机制[J].现代生物医学进展,2009,9(10):1835-1837.
　　[5]Calvo TR,Lima ZP,Silva JS,et al.Constituents and antiulcer effect of Alchornea glandulosa:activation of cell proliferation in gastric mucosa dur-ing the healing process[J].Biol Pharm Bull,2007,30:451-459.
　　[6]陈玲,邹栩.全球心血管药物研发动态[J].中国新药杂志,2010,19(1):8-16.
　　[7]Basra SS1, Tsai P, Lakkis NM.Safety and efficacy of antiplatelet and antithrombotic therapy inacute coronary syndrome patients with chronic kidney disease.JAm Coll Cardiol. 2011, 58(22):2263-9.
　　[8]Weitz JI,Eikelboom JW,Samama MM,et al.New antithrombotic drugs: Antithrombotic therapy and prevention of thrombosis, 9thed: Americancollege of Chest physicians evidence-based clinical practice guidelines. 2012,141(2suppl):120-151.
　　[9]Rashid MA,Parker MJ.Anticoagulation management in hip fracture patients on warfarin[J].Int J Care Injured. 2005,36:1311-1135.
　　基金项目：“十二五”国家科技重大专项重大新药创制课题，课题名称：合肥医工医药创新药物孵化基地建设（NO：2012ZX09401006）。
　　作者简介：储昭兴，男，硕士，主管药师。
　　*通信作者：李家明，男，教授，博士生导师。
　　
　　
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