五味子酯甲抑制肝窦内皮细胞功能及血管新生的活性评价

来源:用户上传      作者: 朱春雾　吕靖　赵志敏　陶艳艳　刘成海

　　[摘要]探讨五味子酯甲对肝窦内皮细胞细胞功能及血管新生的影响。0～40μmol・L-1五味子酯甲与SK-HEP-1细胞孵育24h，MTT法评估五味子酯甲对SK-HEP-1细胞活力的影响。血管内皮生长因子（VEGF）诱导SK-HEP-1增殖，以VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼为对照，同时设空白对照组，五味子酯甲与SK-HEP-1细胞孵育，EdU法检测细胞增殖；荧光探针法检测胞内NO含量和NOS活性；细胞迁移、Matrigel管腔形成实验检测细胞管腔形成；大鼠主动脉环实验检测血管生长变化；转基因斑马鱼实验观察斑马鱼节间血管、功能血管数变化。与空白对照组比较，VEGF诱导SK-HEP-1细胞增殖、NO含量和NOS活性升高；与模型组比较，五味子酯甲显著抑制VEGF诱导的SK-HEP-1细胞增殖、降低NO含量和NOS活性。五味子酯甲能够显著抑制VEGF诱导的SK-HEP-1细胞迁移和管腔形成，抑制大鼠主动脉环血管形成；对转基因斑马鱼节间血管具有显著抑制作用，显著减少斑马鱼功能血管数量。五味子酯甲能够抑制内皮细胞功能，且具有抑制血管新生活性的作用。
　　[关键词]五味子酯甲；肝窦内皮细胞；血管新生；肝纤维化
　　血管新生是指在原有血管结构的基础上通过芽生或套叠增生的方式形成新血管的生物学过程。肝脏在生理和某些病理情况下均可见到血管新生，生理性见于肝脏再生，病理性可见于肝纤维化、肝硬化。研究表明血管新生与慢性肝炎、肝纤维化进程有关，甚至是其促进因素。血管新生是肝纤维化的关键病理变化，能促进细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）生成、门脉高压的产生，现已证实抗血管新生治疗可有效阻止肝纤维化进展。肝窦内皮细胞（liver sinusoid endothelial cell，LSEC）是肝纤维化血管新生的细胞学基础。五味子味酸，甘，性温，具有收敛固涩、补肾宁心、益气生津等功效，含木脂素类、三萜类、倍半萜类、生物碱类、有机酸、挥发油等多种化学成分，五味子酯甲是木脂素类成分之一，能直接吸收入血，发挥抗肝纤维化作用。本研究采用血管内皮生长因子（vascular en-dothelial growth factor，VEGF）诱导SK-HEP-1细胞增殖、细胞迁移与管腔形成、大鼠主动脉环实验与斑马鱼模型，进一步评价五味子酯甲抑制肝窦内皮细胞功能及血管新生的活性。
　　1 材料
　　五味子酯甲购自上海融禾医药科技发展有限公司；索拉非尼（sorafenib），VEGF/PDGF受体酪氨酸激酶及丝/苏氨酸激酶抑制剂购自Bayer公司。
　　SK-HEP-1细胞株（ATCC Number：HTB-52TM）购自中国科学院上海细胞库，为内皮来源人肝癌细胞株。
　　SD大鼠，6～7周龄，SPF级，购于中国科学院上海实验动物中心，许可证号SYXK（沪）2007-0005。
　　Minimum Essential Medium（MEM），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自GIBCOTM公司；二甲基亚砜（DMSO），Fibronectin噻唑蓝（MTT）购自Sigma公司；Recombinant Rat Vascular Endothelial GrowthFactor（VEGF Rat）购自Prospe公司；EdU细胞增殖试剂盒（Cell-LightTM EdU DNA Cell Proliferation Kit）购自广州锐博生物科技有限公司；NO荧光探针，NOS试剂盒，结晶紫染液购自碧云天生物技术研究所。Matrigel购自BD Biosciences公司。Transwell24孔板购自美国Coming公司。
　　2 方法
　　2.1 细胞培养 SK-HEP-1细胞以10%FBS/MEM培养液培养，每3～4d传代1次。
　　2.2 药物配制 ①每1L MEM培养基含MEM干粉1袋，NaHCO，2.2g，4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）2.38g，青霉素0.0625g，链霉素0.1g。②胰酶1L含Trysin 2.5g，乙二胺四乙酸（EDTA）0.2g，NaCl8g，KCl 0.4g，Na2HPO4・12H2O 0.134g，KH2PO4 0.06g，NaHCO30.35g。③L-谷氨酰胺100mL：L-谷氨酰胺2920mg加ddH2O至100mL。④PBS缓冲液1L含NaCl8g，KCl 0.2g，Na2HPO4・12H2O 3.58g，KH2PO4 0.26g。
　　2.3 细胞模型 SK-HEP-1细胞以每孔8000个接种于96孔板，待细胞长至亚单层，弃培养液，VEGF以0.4%胎牛血清稀释，20μg・L-1VEGF与SK-HEP-1细胞共孵育24h，同时设0.4%胎牛血清培养液作为对照。
　　2.4 MTF法 药物孵育24h后，弃药液，加入0.5g・L-1MTY工作液，孵育4h。小心吸弃工作液，加入DMSO100μL/孔，至充分溶解，在微孔板扫描分光光度计上测定吸光度A490。
　　2.5 Edu法 药物孵育24h后，弃培养液，每孔加入50μmol・L-1EdU溶液100μL孵育2h后，弃上清，每孔加入4%多聚甲醛100μL室温固定15min，0.2%甘氨酸孵育10min，PBS洗涤5min，2次，0.5%Triton X-100透膜10min，PBS洗涤5min，Appllo染色反应液避光孵育30min，PBS洗涤5min，DAPI（1：1000）避光孵育5min，PBS洗涤5min，2次，Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader采集图像，Cellomics Cell Health Profiling BioApplicationSoftware对图像进行分析。 　　2.6 荧光探针法 胞内NO水平的检测：药物孵育24h后，弃培养液，每孔加入原位装载5μmol・L-1DAF-FMDA（NO探针）100μL孵育20min后，PBS洗涤3次。Thermo scientific varioskan flash光谱扫描多功能读数仪上检测，激发波长495nm，发射波长515nm。NOS活性检测：药物孵育24h后，弃培养液，每孔加入NOS检测缓冲液、检测反应液各100μL，孵育2h后PBS洗涤3次。Thermo scientificvarioskan flash光谱扫描多功能读数仪上检测，激发波长495nm，发射波长515nm。
　　2.7 细胞迁移试验 Transwell小室的下室以1mg・L-1纤维粘连蛋白37℃细胞培养箱内包被过夜。细胞同步化后，胰酶消化，离心，用0.4%胎牛血清调整细胞密度至2×105个/mL，上室加入细胞和药物培养液各150μL，药物组各设3个复孔，下室加5%胎牛血清细胞培养液600μL孵育8h后弃上下两室培养液，4%多聚甲醛固定细胞，PBS洗涤，结晶紫染色10min，PBS洗涤。Olympus倒置显微镜下观察细胞迁移情况，拍摄。
　　2.8 细胞管腔形成试验 每孔加100μL Matri-ge1聚合1h，细胞胰酶消化后调整细胞浓度至5×104个/mL与药物培养液按1：1混合，每孔200μL铺在matrigel上，孵育8h。Olympus倒置显微镜下观察，拍摄。
　　2.9 大鼠主动脉环试验 将主动脉分切成1mm血管环备用。每孔60μL matrigel聚合20min后，加入一主动脉环，放置10min。另加60μLma-trigel于主动脉环上，聚合30min。加100μL含青链霉素的2%FBS，孵育6d后弃培养液，0.4%FBS饥饿6h。Olympus倒置显微镜下观察，拍摄，计作0h；加药物培养液，孵育24h，Olympus倒置显微镜下观察，拍摄，计作24h。
　　2.10 斑马鱼试验 转基因斑马鱼（VEGFR：GFP）受精卵发育24h，移至96孔板中，每孔预加入受试样品溶液，每5个孔为同一浓度，对照为胚胎培养用水加相应量的助溶剂，加盖封闭，置于光照培养箱（28℃）内继续发育24h，于倒置显微镜下观察，记录节间血管的血流数。麻醉，荧光显微镜下对节间血管进行计数并拍照。观察结束后，4%多聚甲醛中固定，甲醇脱水，丙酮透化，碱性磷酸酶染色，显微镜下拍照。
　　2.11 统计学处理 计量资料用x±s表示。所有数据均使用SPSS12.0软件包进行统计学分析，组间比较使用单因素方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。
　　3 结果
　　3.1 五味子酯甲对SK-HEP-1细胞活力的影响分别以含2.5～40μmol・L-1五味子酯甲培养液孵育SK-HEP-1细胞24h，MIT法检测细胞活力，2.5～20μmol・L-1五味子酯甲对SK-HEP-1细胞活力明显抑制，40μmol・L-1对SK-HEP-1细胞活力抑制率达到70%，后续药效试验选择2，20μmol・L-1五味子酯甲（图1）。
　　3.2 五味子酯甲对VEGF诱导的SK-HEP-1细胞增殖的影响 与空白对照组相比，VEGF刺激明显诱导SK-HEP-1细胞增殖；与索拉非尼作用相似，2，20μmol・L-1五味子酯甲显著抑制VEGF刺激的SK-HEP-1细胞增殖，具有一定剂量依赖性（图1）。
　　3.3 五味子酯甲对SK-HEP-1 细胞内一氧化氮（NO）含量与NOS活性的影响与空白对照组相比，VEGF刺激的SK-HEP-1细胞内NO含量与NOS活性明显升高；索拉非尼、五味子酯甲降低VEGF诱导的SK-HEP-1细胞内NO含量与NOS活性，其中2，20μmol・L-1五味子酯甲呈现一定剂量依赖性（图2）。
　　3.4 五味子酯甲对VEGF诱导的SK-HEP-1细胞迁移的影响 与空白对照组相比，VEGF组促进SK-HEP-1细胞迁移；与VEGF组相比，2.5μmol・L-1索拉非尼组、20μmol・L-1五味子酯甲组明显抑制SK-HEP-1细胞迁移（图3）。
　　3.5 五味子酯甲对VEGF诱导的SK-HEP-1细胞管腔形成的影响 与空白对照组相比，VEGF促进SK-HEP-1细胞管腔形成；与VEGF组相比，2.5μmol・L-1索拉非尼组、20μmol・L-1五味子酯甲组均明显抑制SK-HEP-1细胞管腔形成（图3）。
　　3.6 五味子酯甲对VEGF诱导的大鼠主动脉环血管生长的影响 与空白对照组相比，VEGF组促进大鼠主动脉环血管生长；与VEGF组相比，2.5μmol・L-1索拉非尼组、20μmol・L-1五味子酯甲组均显著抑制大鼠主动脉环血管生长（图3）。
　　3.7 五味子酯甲对斑马鱼血管的影响 与空白对照组相比，100μmol・L-1索拉非尼组绿色荧光标记的斑马鱼血管数明显减少，五味子酯甲组无明显变化；与空白对照组相比，100μmol・L-1索拉非尼、100μmol・L-1五味子酯甲斑马鱼节间血管数显著减少；与空白对照组相比，100μmol・L-1索拉非尼、100μmol・L-1五味子酯甲可显著减少斑马鱼功能血管数量（图4）。
　　4 讨论
　　肝硬化患者和实验性肝纤维化动物肝脏中均能见到血管新生现象，血管新生既可以是慢性肝损伤后组织修复中微血管重塑的表现，也与肝纤维化的发展有密切的关系，采用索拉非尼干预血管新生可减轻肝纤维化。促进血管新生的细胞因子有VEGF，转化生长因子-β（transforming growth fac-tor-β，TGF-β），成纤维细胞生长因子（fibroblastgrowth factor，FGF），血小板源生长因子（platelet de-rived growth factor，PDGF）等。纤维化时，肝脏中VEGF表达上调，主要表达在内皮细胞（endothelialcell，EC）和活化肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）中，可促进EC分裂、增殖，迁移，诱导纤维蛋白原激活物和胶原酶的表达，增加血管的通透性，使用特异性中和抗体阻断VEGF信号可减轻肝纤维化。
　　SK-HEP-1细胞株是无限增殖的人肝窦内皮细胞株，具备肝窦内皮细胞的两大关键特点：一是窗孔结构，二是细胞内吞作用（肝窦内皮细胞关键功能特点），因此，SK-HEP-1细胞是进行体外物质筛选理想的细胞载体。索拉非尼是一种多激酶抑制剂，不仅可以抑制多种受体酪氨酸激酶活性，还可以抑制丝氨酸―苏氨酸激酶活性。作为多靶点受体酪氨酸激酶抑制剂，该药物不仅具有抑制血管新生作用，最近一些研究表明，该药具有良好的抗肝纤维化作用。
　　本研究以人肝窦内皮细胞株SK-HEP-1为对象，建立VEGF诱导SK-HEP-1细胞增殖模型。一氧化氮（NO）是由一氧化氮合酶（NOS）催化L-精氨酸与氧分子结合而生成。NO与肝纤维化密切相关。本研究显示，五味子酯甲能明显降低VEGF诱导的SK-HEP-1细胞增殖；降低胞内NO含量，NOS活性；抑制VEGF诱导的SK-HEP-1细胞迁移，管腔形成，大鼠主动脉环血管新生。
　　斑马鱼基因组与人类基因组具有高度同源性，这一优势使其在建立各种疾病模型和药物筛选中得到普遍应用。近年来，斑马鱼也逐渐被用作筛选血管新生药物的模型。本研究显示，100μmol・L-1五味子酯甲显著减少斑马鱼节间血管与功能血管数量，在整体水平上具有一定抑制血管新生作用。
　　肝窦内皮细胞是具有诸多功能的肝脏中的一种间质细胞，在急、慢性肝损伤的发生、发展中起着重要的作用。本研究初步发现五味子酯甲可抑制VEGF诱导的SK-HEP-1细胞增殖，抑制VEGF诱导的SK-HEP-1细胞迁移、管腔形成以及大鼠主动脉环形成，抑制斑马鱼血管新生活性，其作用特点可能与减少细胞内NO含量及NOS活性有关。
　　[责任编辑 马超一]
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