纳豆激酶发酵过程放大策略的研究
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作者: 王万春 李天文 薛建
摘 要：作为一种新型的溶血栓药物，纳豆激酶与当前使用的溶血栓药物相比，具有安全性好、作用迅速，成本低，以及可通过液体发酵大规模生产等优点。利用单因素试验，对在纳豆激酶生产菌液体发酵中溶解氧和剪切力对生产纳豆激酶的影响，从而确定纳豆激酶发酵罐发酵放大的主要控制策略。结果表明，纳豆激酶对溶解氧浓度要求较高，并且可以承受较低的搅拌桨剪切力。
关键词：纳豆激酶；发酵放大策略；溶解氧；剪切力
中图分类号：TS214.2 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20150932003
纳豆是盛行于日本的传统发酵大豆食品，至今已有近2000年的历史，它不仅作为食品被广泛食用，而且还作为药品用来预防和治疗心脑血管性疾病[1]。Sumi 等人[2] 1987 年从纳豆中提取出具有溶血栓功能的物质，将其定名为纳豆激酶。该酶能显著溶解机体内外血栓，明显缩短优球蛋白的溶解时间，并能激活静脉内皮细胞产生纤维蛋白溶酶原激活剂 （t- PA）[3- 5]。
一般的工业发酵过程研究可分为实验室研究，小试及中试三个阶段，以验证并完善发酵工艺，进行大规模生产。这一研究过程中，在实验室研究所获得的产物的产量往往较高，而在小试和中试的放大过程中，产物的产量不断下降，无法重现实验室试验的结果，影响了其工业生产的效率，因此对发酵过程的放大策略进行研究，尽可能地降低“放大效应”，既具有重要的理论意义，又会产生良好的经济效益。
本研究主要利用摇瓶发酵研究溶解氧和剪切力对纳豆激酶发酵的影响，来确定其发酵罐生产的主要放大策略，从而为纳豆激酶作为新型溶栓药物的未来工业化生产提供了科学依据和前期基础，对预防和治疗心脑血管栓塞性疾病具有一定的意义。
1 材料与方法
1.1 菌种
纳豆激酶生产菌（吉林农业科技学院生物工程学院实验室保藏）
1.2 试剂
纤维蛋白原（Fibrinogen），凝血酶（Thrombin），尿激酶（Urokinase），购于Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.3 培养基
斜面培养基：LB固体培养基（蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，1琼脂粉5g/L，pH 7.0，）
液体种子培养基与液体发酵培养基：采用 LB 液体培养基，组成除无琼脂粉外同 LB 固体培养基。
1.4 培养条件
采用LB液体培养基，接种量2%，30℃下摇床培养2d，取发酵上清液测定酶活。
1.5 溶氧量对纳豆激酶活性的影响
摇瓶发酵是空气通过瓶口的介质扩散提供氧气的，可通过降低摇瓶装液量，提高瓶内空气量，提高摇瓶的溶氧水平。在转速一定的情况下，设计6个不同体积的装液量进行单因素优化试验。
1.6 剪切力对纳豆激酶活性的影响
发酵罐采用机械搅拌方式增加溶氧水平，剪切力与搅拌桨转速和搅拌桨半径的平方成正比，因此发酵罐中微生物发酵受剪切力的程度比在摇瓶中的大。在摇瓶中添加玻璃珠可以模拟发酵罐中机械搅拌对微生物发酵的影响。在各组摇瓶中添加玻璃珠：设定1-6个添加数量，装液量均为30ml/250ml，进行单因素优化试验。
1.7 纳豆激酶活力检测
按照Astrup[6]法制备纤维蛋白平板。将不同浓度的尿激酶（UK）标准品（0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6U）点样于新配制的平板上，置于37℃培养箱培养16 h。测定溶圈的垂直直径，计算溶圈面积，制作标准曲线（y=0.475+2.81x，y：溶圈面积/cm2，x：酶活单位/U）。
将纳豆激酶生产菌发酵液进行10000r/m离心，取上清10μL点样于新制备的纤维蛋白平板，根据所测样品的垂直直径计算的面积，利用标准曲线求得相应的酶活性。
2 结果
2.1 溶氧量对纳豆激酶活性的影响
从表1数据可见装液量对纳豆激酶液体发酵的影响很大。在250ml三角瓶中装量为15ml时，产酶酶活最高，随着装液量的增加，酶活逐渐降低。装液量增加至30ml之后，酶活下降至681.49IU/ml，相对酶活降至77%；随着装液量继续增加至35ml和40ml，酶活变化较慢。说明纳豆激酶液体发酵生产过程对溶氧要求较高。
2.2 剪切力对纳豆激酶活性的影响
从表2可见添加玻璃珠模拟剪切力对纳豆激酶活性的影响，随着玻璃珠数量的增加，纳豆激酶活性呈逐渐下降的趋势，说明纳豆激酶发酵生产过程对剪切力较敏感，但即使当加入的玻璃珠增加到3个时，纳豆激酶活性也只降低10%，这表明纳豆激酶在进行发酵罐生产时，搅拌桨可以以较低的速度进行搅拌，从而在不过多影响酶产量的情况下，维持发酵液中的溶氧浓度。
3 讨论
溶解氧是影响发酵过程的最主要因素之一，本研究结果表明，纳豆激酶发酵生产过程中，对溶解氧的要求较高，这表明在今后的发酵罐放大过程中，维持一定的通气量可促进纳豆激酶产量；发酵过程中溶解氧主要受通气、搅拌、罐压、发酵液性质影响，本研究还表明纳豆激酶发酵生产过程对剪切力较敏感，在菌体无法承受较高的剪切力，即发酵罐放大过程中不允许高强度的搅拌。在今后的生产过程中，可以维持较低的搅拌速度，保证纳豆激酶产量。所以本研究可为纳豆激酶今后的发酵过程放大与生产提供一定的理论基础和科学依据。
参考文献
[1]铃木英也，木内斡. 高纤溶活性食品―纳豆开发的现状 [J] .食品の科学，1991（6）：85.
[2] Sumi H，Hamada H，Tsushima H，et al. A novelfibrinolytic enzyme（nattokinase）in the vegetable cheeseNatto；a typical and popular soybean food in the Japanesediet [J] . Experientia，1987，43（10）：1110.
[3] Fujita M，Nomura K，Hong K，et al. Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme（nattoki-nase）in the vegetable cheese natto，a popular soybean fermented food in Japan [J] . Biochem Biophys Res Commun，1993，197（3）：1340.
[4] Fujita M，Hong K，Ito Y，et al. Thrombolytic effect of nattokinase on a chemically induced thrombosis model in rat [J] . Biol Pharm Bull，1995，18（10）：1387.
[5] Chang C T，Fan M H，Kuo F C，et al. Potent fibrinolyticenzyme from a mutant of Bacillus subtilis IMR-NK1 [J] . JAgric Food Chem，2000，48（8）：3210.
[6]Astrup T，Mullertz S. The fibrin plat method for estimating fibrinolytic activity [J].Arch Biochem Biophys，1952，40（3）：346-351.
作者简介：王万春，吉林农业科技学院吉林农业科技学院2010级生物技术专业学生；薛健，博士，讲师，研究方向：农业生物环境与能源工程。
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