环介导等温扩增技术在临床检测中的应用

来源:用户上传      作者: 于　荔

　　[摘要] 目的 探讨环介导等温扩增技术在临床检测中的应用。方法 采用我院2008年10月门诊或住院患者85份试验用的含结核杆菌的阳性痰液和阴性痰液,通过染色涂片镜检和经典PCR的方法及使用改良罗氏培养法进行培养予以定性,并与LAMP法检测结果比较。结果 LAMP法与培养法、Amplicor MTB PCR法检测痰液中结核分枝杆菌的阳性率无明显差异。结论 LAMP法是一种新型的核酸扩增方法;由于它是近年来兴起的一种技术,是一种便捷、特异性强和灵敏度高的快速基因检测技术。
　　[关键词] 环介导等温护增技术;临床检测
　　[中图分类号] R446.1 [中图分类号] A[文章编号] 1673-9701(2009)24-43-02
　　
　　日本学者Notomi等[1]于2000年发明了一种全新的核酸扩增方法――环介导等温扩增技术(loop-mediated isothemal amplifi cation LAMP),其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件(65℃左右)保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应[2]。不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程,该技术的问世解决了基于核酸的分子生物学检测技术的诸多难题,使其作为快速诊断方法成为可能.,已经被广泛用于细菌、病毒和寄生虫等的检测,动物胚胎性别鉴定,食品卫生检疫及基因芯片的开发等,我们采用LAMP法对痰液中和培养基中的结核分枝杆菌进行检测,并分析报道如下。
　　
　　1材料与方法
　　
　　1.1试验样本
　　试验用的含结核杆菌的阳性痰液和阴性痰液来自选自我院2008年10月门诊或住院患者85份,全部样本均通过染色涂片镜检和经典PCR的方法及使用改良罗氏培养法进行培养予以定性。
　　1.2主要试剂
　　Bst DNA聚合酶与Tai I限制性内切酶购自英国Biolabs公司,三甲铵乙内酯(Betaine)购自瑞士Fluka公司。硫酸镁购自美国Sigma公司,SYBR染料购自美国Invitrogen公司,DNA标志物购自北京天根生化科技有限公司,脱氧核苷三磷酸(dNTP)购自北京鼎国生物技术有限责任公司。
　　1.3统计学方法
　　采用SPSS 11.0统计学处理软件,P<0.05为差异具有显著性。
　　
　　2LAMP反应DNA引物的设计利用
　　
　　ICBgyrB数据库及RIDOM数据库寻找结核分枝杆菌基因序列(GenBank accession No.CP000611)利用软件选取结核分枝杆菌的特异性序列,该序列利用PrimerExplorerlV软件进行进一步分析,设计1套6种引物分别是前外引物B3、后外引物F3、前内引物FIP、后内引物BIP、环状引物LF及I,B,上述引物识别目标基因序列中的8个特定区域。所有引物由上海赛百胜基因技术有限公司合成。25ulLAMP反应体系:FIP和BIP各1.6pmol/L, F3和B3各0.2μmol/L, 1.4mmol/L dNTPs、 1.0mol/L Betaine、6.0mmol/LMgSO4、0.8mmol/L甜菜碱,2mmol/L dNTP,65℃反应60min,80℃5min终止反应,LAMP扩增产物取5μl,在质量分数为2%的琼脂糖凝胶进行进行电泳分析,同时LAMP扩增的每个管中加入1.0μl 20×Smartgreen荧光染料混匀,在紫外灯(302nm)下显影。
　　
　　3结果
　　
　　见表1,结果表明,LAMP法与培养法、Amplicor MTB PCR法检测痰液中结核分枝杆菌的阳性检出率无明显差异(P> 0.05)。
　　
　　
　　4讨论
　　
　　LAMP是一种崭新的DNA扩增方法,具有简单、快速、特异性强的特点。LAMP原理[3]:引物的设计:基于靶基因3’端的F3c,F2c 和F1c区以及5’端的B1,B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。FIP引物:上游内部引物,由F2区组成,F2 区与靶基因3’端的F2c区域互补,与靶基因5’端的F1c区域序列相同。F3引物:上游外部引物,由F3区组成,并与靶基因的F3c 区域互补。BIP引物:下游内部引物,由B2区组成,B2区与靶基因3’端的B2c区域互补,与靶基因5’端的B1c区域序列相同。
　　DNA在65℃左右处于动态平衡状态,任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时,另一条链就会解离,变成单链。反应中链置换型DNA聚合酶,能使后阶段退火的引物置换前面引物所形成的链,在其作用下,以FIP引物砣区段的3’末端为起点,与模板DNA互补序列配对,启动复制一条新链。F3引物与靶DNA的F3c序列杂交,又通过链置换型DNA聚合酶的作用,开始靶DNA互补链的合成,同时置换出FIP引物合成的DNA链。被置换出的DNA链在5’末端存在互补的Flc和F1区段,能发生自我碱基配对,形成环状结构。同时这条单链DNA,又可作为模板,在另一端结合BIP引物和B3引物合成一条双链,并置换出一条单链DNA。此时,被置换的单链DNA两端都存在互补序列,自我碱基配对后整条链呈现哑铃状结构,该结构是LAMP扩增循环的起始结构[4]。在哑铃结构中,以3’末端的F1区段为起点,以自身为模板,进行DNA合成延伸。同时,FIP引物上的砣与环上的F2c杂交,启动新一轮链置换反应。其置换出的单链核酸也会形成环状结构,BIP引物上的B2与环状结构上存在的B2c杂交,启动又一轮扩增。反应终产物是花椰菜样的茎一环结构DNA组成的混合物,即由在同一条链上互补序列周而复始形成大小不一的结构[5]。
　　LAMP具有许多迄今为止的扩增方法无法比拟的优点:(1)只需一恒定温度就能扩增反应,不需要特殊试剂,不需要预先进行双链DNA的变性。(2)高特异性:应用6个区段,4种引物,并且这6个区段的顺序也有规定。原理上LAMP扩增的特异性很高,因此可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否,即能够进行细菌或病毒的定性检测。(3)快速、高效扩增:整个扩增在不到lh即可完成,且产率可达到0.5mg/mL。若在引物上再进一步改进,可大大提高其扩增效率,扩增时间在原来的基础上减少1/3~1/2。(4)灵敏度高:扩增模板可达10拷贝或更少。(5)步骤简单:扩增RNA只要在DNA基因扩增试剂的基础上加上逆转录酶,就能够完全像DNA基因扩增那样,一步实现RNA扩增。(6)鉴定简便:在核酸大量合成时,从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合,产生副产物――焦磷酸镁沉淀。它有极高的特异性,只要用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度就能判断扩增与否,缺点只能有2种结果:扩增和不扩增。靶序列长度控制在300bp以下,一旦产生非特异性扩增,则不易鉴别[6]。
　　通过本组数据观察,LAMP法与培养法检测痰液及Amplicor MTB PCR法中结核分枝杆菌结果比较,数据检测无明显差异,(P>0.05),进一步说明LAMP法检测准确性和适用性,由于结核分枝杆菌的培养周期较长,使用罗氏培养基进行培养所需时间长达几个月[7],不利于结核分枝杆菌的快速检测。PCR所需要的一系列变性、退火、延伸等复杂程序,使用扩增反应在恒温的条件下进行,没有DNA的变、复性过程,节省了大量时间;同时减少DNA大片段聚合酶与扩增核酸的污染机会;需要的试验设备大大简化。

　　总之,LAMP法是一种新型的核酸扩增方法;它是近年来兴起的一种技术,是便捷、特异性强和灵敏度高的快速基因检测技术。
　　
　　[参考文献]
　　[1] Notom T,Okayama H,Masubuchi H,et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic Acids Research,2000,28(12):63.
　　[2] 蔡哲钧,冯杰雄. 环介导等温扩增技术及在传染性疾病检测中的应用[J]. 国际流行病学传染病学杂志,2006,33(5):343.
　　[3] 汪一帆,郭潮潭. 环介导等温扩增技术及在感染病诊断中的应用[J]. 中国卫生检验杂志,2008,18(9):1933.
　　[4] Kimura H, Ihira. M, E nomoto Y, et al. Rapid detection of herpes sim-plex virus DNA in cerebrospinal fiuid: comparison between loop -mediated isothermal amplification and real-time PCR[J]. Med Microbiol Immunol(Berl),2005,194(4):181-185.
　　[5] Parida M, Posadas G’Inoue S, et al. Real-time reverse transcription loop -mediated isothermal amplification for rapid detection of West Nile virus[J]. J Clin Microbiol,2004,42:257-263.
　　[6] 蔡哲钧. 核酸环介导等温扩增技术[J]. 国际检验医学杂志,2006,27(12):1092-1093.
　　[7] van der VIiet RA. Schukkink B, van Gemen,et a1. Nucleicacid sequencc-based amplification(NASBA) for the identification of mycobacteria[J]. J Gen Micrebiol,1993,139:2423-2429.
　　(收稿日期:2009-03-23)

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