谈酶联免疫吸附试验的检验体会

来源:用户上传      作者: 尹晓梅　裴战军

　　[关键词] ELISA；检验；因素
　　
　　由于酶联免疫吸附试验（ELISA）以灵敏度较高、，特异性强不需要特殊设备，所以被广泛应用于各种抗原和抗体测定［1］，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，一般涉及到样本的收集保存、试剂准备、加样、温育、洗板、显色、比色、结果判断和结果报告等方面，其中任一步骤的不当都会影响测定结果，尤以加样、温育和洗板步骤为甚，只有避免了这些因素才能保证实验结果的准确性和可靠性［2］。我将各个环节应注意的问题总结于下，以期给同行带来一些启发，提高试验质量。
　　
　　1 样本的收集保存
　　
　　 疾病预防控制系统用于ELISA测定的样本最常用的是血清（浆），在处理和保存样本方面要考虑以下几个方面：①要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素集团，有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如血清样本中血红蛋白浓度较高，则很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色；②血液标本存放足够的时间，使纤维蛋白充分析出。最好离心后使用。必要时可置37℃，2h促进凝集。要注意尽量避免细菌污染。细菌生长所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用或对实验产生非特异性干扰；③以无菌操作分离的血清样本可在2～8℃保存1周，需长时间保存者，应在- 80℃以下冻存，冰冻保存的血清样本禁忌反复冻融，防止假阴性结果的出现；④血清样本如出现浑浊或絮状物时，应离心沉淀后取其上清液检测。
　　
　　2 试剂准备
　　
　　在实验开始前，从4℃取出的试剂，要平衡到室温后方可使用。室温控制在18～25℃。这是试剂准备最为关键的一步，目的是为了在后面的温育反应步骤中，能使反应微孔内的温度较快地达到所要求的温度，以满足测定要求，防止对一些弱阳性样本的检测出现假阴性。
　　
　　3 加血清样本和反应试剂
　　
　　血清样本要用微量移液器加入，必须注意：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异性吸附；溅出会对邻近孔产生污染；出现气泡则反应液界面有差异。加入试剂时，如用滴瓶滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异性吸附，引起非特异性显色。所以，有时用相同的试剂盒测同一份样本会出现这次结果为阳性而下次结果为阴性的现象。
　　
　　4 温育
　　
　　温育是ELISA测定中影响测定成败最关键的因素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。要保证在设定的温度下有足够的反应时间［3］，严格来讲，这个时间应该从微孔板反应溶液温度由室温升至37℃时计时。平时实验中，往往是从微孔板一放入温箱即开始计时，这样很容易造成弱阳性样本因温育时间不够而测不出的问题。所以，温育应尽量采用水浴，让微孔板浮于水面上；或将浸透水的纱布放在大饭盒中成一个湿盒，放温箱中，这就可以使反应溶液温度迅速与温箱平衡。
　　
　　5 洗板
　　
　　固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中的非特异成份分离开来，来保证ELISA测定的特异性。所以洗板对于ELISA测定也是极其关键的，它将非特异吸附的成份分离开。洗板时要注满洗液，防止相邻孔间的污染［4］，但不能有气泡。洗板机使用前应检查管道是否通畅，或漏气，针头是否有堵塞。洗涤液要勤更换，以免长菌而影响结果。
　　
　　6 显色
　　
　　显色要注意保证足够的反应时间［5］，严格按说明书要求做。从理论上讲，以HRP为标记酶的ELISA试剂，37℃ 30 min才可以使HRP的的底物催化反应完全，尽管在最初的10分钟内，绝大部分催化反应即可完成。否则，弱阳性
　　样本孔因反应不充分而被漏检。同时，以OPD为底物者，显色过程要避光进行。
　　
　　7 比色
　　
　　比色测定时，一定要注意酶标仪的波长是否已调至合适或所用滤光片是否正确。双波长比色测定具有能排除由微滴板本身、板孔内样本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的优点，所以，在ELISA测定比色时最好使用双波长比色。
　　
　　8 结果判断、报告
　　
　　区县级疾病预防控制中心实验室的ELISA测定一般为定性测定，对样本中是否含有待测抗原或抗体作出“有”或“无”的判定，分别用“阳性”和“阴性”表示[6]。其“阳性”和“阴性”的判定依据是试剂盒所确定的阳性判断值（Cut-off）。
　　
　　参考文献
　　[1] 宋炳荣,杜彩霞,崔娜,等.ELISA一步法检测乙型肝炎病毒标志物影响因素的实验研究［J］.实用医技杂志,2004,9(11):65.
　　［2］邓永福.ELISA实验影响因素探讨[J].四川省卫生管理干部学院学报,2004,23(3):17-18.
　　［3］徐锡霞,邓巍.温育条件对ELISA定性测定HBsAg结果的影响[J].实用肝脏病杂志,2005,8(1):18-20.
　　［4］裴洪贵,夏志鸿,甘云波.ELISA法检测HBsAg污染途径初探[J].贵州医药,2003,27(8): 90-91.
　　［5］张志奇,张战军.ELISA检测显色结果影响因素的分析[J].洛阳医专学报,2001,19(2):72.
　　[6] 于振喜,李连洁.用HIV法检测HIV抗体时如何避免“花板”［J］.中国医药导报，2006,5(23):56.
　　 (收稿日期：2008-10-27)

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