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神经细胞自噬的研究进展

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  (广州中医药大学第一附属医院,广东 广州 510405)
  摘 要:自噬是溶酶体降解利用细胞内物质成分的过程,是近年来分子生物学的研究热点。自噬对应激状态下神经细胞存活、清除神经细胞内衰老细胞器和错误折叠蛋白等起重要作用;其可作为神经细胞的保护机制,也可作为神经细胞死亡方式之一。缺血缺氧是神经细胞自噬激活的重要诱因之一。综述自噬的过程及形态特征;自噬的特性及功能;自噬体形成的一般分子机制;自噬对神经细胞的影响;自噬与神经退行性疾病;缺血缺氧下自噬调节的分子机制;自噬的诱导与抑制;自噬的检测等。
  关键词:自噬;神经细胞;分子机制;综述
  中图分类号:R338文献标识码:A文章编号:1673-7717(2011)03-0453-03
  Review in Neuronal Autophagy
  
  FANG Yong-qi, LIU Lin
  (The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405,Guangdong,China)
  Abstract:Autophagy is the regulated process by which cytoplasmic organelles and other substances are delivered for lysosomal degradation. It is the research point of the molecular biology in recent years. Autophagy plays a major role in neuronal survival and the clearance of damaged or long-lived proteins and organelles. It can not only protect the neurons but also lead to neuronal death. Hypoxic-ischemic damage is a major inducer of autophagy. This review summarizes the process, morphological features, characteristic, function, general molecular mechanism of autophagy, and the influence to the nerve cell and neurodegeneration disease; the regulate mechanism under hypoxia-ischemia; inducement and inhibit;inspect of autophagy.
  Key words:Autophagy;Neuronal;Molecular mechanism;Review
  
  
  
  收稿日期:2010-10-09
  基金项目:广东省科技厅攻关项目(2007B031408005)
  作者简介:方永奇(1957-),男,广东惠来人,研究员,博士研究生导师,研究方向:中医药治疗脑病。
  
  细胞的死亡方式有2种:细胞坏死和程序性细胞死亡,其中程序性细胞死亡有Ⅰ型(细胞凋亡)和Ⅱ型(自噬性细胞死亡)两种类型[1]。自噬(autophagy),即自体吞噬,是指溶酶体降解利用细胞内物质成分(如长寿命蛋白和某细胞器)的过程[1-3]。它具有高度保守性,乃真核细胞所特有的自我保护机制,自噬是近年来分子生物学的研究热点。自噬贯穿于正常细胞生长发育和生理病理过程,对防止如神经退行性病变、肿瘤、心肌病、病原微生物侵入感染等疾病以及对防止老化、延长寿命有积极作用,但过多细胞自噬则引起细胞的过量损伤导致细胞死亡。本文仅就神经细胞自噬相关研究进行综述。
  1 自噬概述
  1.1 自噬的过程及形态特征
  自噬的过程:前自噬体结构(Photosphere,PAS):细胞接受自噬诱导信号(如饥饿、生长因子缺乏、缺血缺氧、微生物感染、细胞器损伤、蛋白质折叠错误或聚集、DNA损伤、放疗、化疗等)后,来源于内质网的非核糖体区域、高尔基体等的自噬体膜脱落,形成杯状分隔膜,包绕被降解物。自噬体(autophagosome)[4]:PAS逐渐延伸,将要被降解的胞浆成分完全包绕形成密闭的球状自噬体。自噬溶酶体(autolysosome):自噬体通过细胞骨架微管系统运输至溶酶体,与之融合形成自噬溶酶体,二者的内容物合为一体,并降解其内成分,自噬体膜脱落再循环利用,产物(氨基酸、脂肪酸等)被输送到胞浆中,供细胞重新利用,而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。电镜下观察到自噬体有两个特征:一是双层膜,二是内含胞浆成分,如线粒体、内质网碎片等。
  1.2 自噬的特性及功能
   自噬具有如下特性:维持细胞稳态:细胞正常情况下很少发生自噬,除非有诱发因素的存在。自噬既可以作为一种防御机制清除胞质内受损的细胞器、代谢产物,进行亚细胞水平上的重构,保护受损的细胞,同时它作为一种细胞死亡程序诱导细胞主动性死亡[5]。自噬过程很快,被诱导后8min即可观察到自噬体形成,2h后自噬溶酶体基本降解消失。自噬的可诱导性:快速合成自噬相关蛋白,导致大量自噬体的快速形成。批量降解:这是与蛋白酶体降解途径的显著区别。“捕获”胞浆成分的非特异性:自噬的速度快、量大。自噬的保守性:自噬有利于细胞存活,因此自噬普遍被保留下来。
  自噬具有维持细胞自稳的功能,如果将自噬相关基因突变失活,则神经元会发生大量聚集蛋白,并出现神经元退化。自噬主要有两方面的作用,其一,作为细胞的保护机制,防止细胞死亡。如一些器官有很强的募集自噬标志ATG8到自噬液泡中的能力[6],当自噬受到抑制时,对细胞的生存有伤害性作用。其二,对细胞死亡起作用[7]。自噬一旦达到损伤阈值时,细胞就进入凋亡通路。
  1.3 自噬体形成的一般分子机制
   自噬体发生的分子机制主要有以下4个步骤:①自噬的诱导:雷帕霉素作用的靶位点(Target of rapamycin,TOR)在调节细胞生长和自噬的发生过程有重要作用[8]。②自噬体的形成:自噬体的形成依赖于两个泛素样结合系统Apgl2-Apg5和Apg8系统[9]。③自噬体的运输、融合:Rho涉及细胞骨架,与自噬体的运输有关。④自噬体的裂解: Atg15和Atg22起重要作用。
  2 神经细胞自噬
  2.1 自噬对神经细胞的影响
  自噬作为一种重要的物质代谢活动,其对维持缺血缺氧等应激状态下神经细胞存活、清除神经细胞内衰老细胞器及错误折叠蛋白等起重要作用。通过缺血缺氧动物模型和细胞培养实验,证实了自噬不但对营养缺乏状态下的神经细胞起保护性作用,而且可以促进神经细胞存活[10-12]。应用3-甲基腺嘌呤(3-MA,自噬抑制剂)可减少神经细胞自噬发生[13]。在小脑共济运动失调的模型中,抑制HEK293细胞的自噬能增加细胞的死亡[14]。在某些条件下自噬也能导致细胞死亡,甚至能促进细胞的死亡[15]。Spencer等[16]通过3-MA抑制细胞自噬不仅不能保护神经细胞,相反能轻微的加强细胞的死亡。

  2.2 自噬与神经退行性疾病
  神经变性疾病可被归类为蛋白质构象疾病。当一种或一组特定的蛋白出现变构或错误折叠并在细胞内以毒性结构形式积聚时,这些疾病就会发生。近来的研究显示:自噬相关通路的缺陷可能会导致帕金森病(Parkinson's disease,PD)、阿尔采末病(Alzheimers' disease,AD)和亨廷顿氏舞蹈病(Hun-tington 's disease,HD)等多种神经变性疾病。自噬途径如果不能有效的降解废旧的胞质,就会导致其在细胞内的堆积,从而诱导疾病的发生[17]。自噬功能的紊乱与AD有密切关系,但具体的机理还不是很清楚[18-19]。自噬功能的异常是PD的诱因之一[20],PD相关蛋白DJ-1,通过JNK通路调节自噬 [21]。
  2.3 缺血缺氧下自噬调节的分子机制
  缺血缺氧是自噬激活的重要诱因之一[22]。抑制自噬信号的通路有:I型PI3K通路,接受胰岛素受体传来的信号(血糖水平高抑制自噬);mTOR通路:接受多种上游信号,如I型PI3K、IGF-1/2、MAPK,能感受营养和能量的变化。激活自噬信号的通路有:III型PI3K通路。
  2.3.1 mTOR对自噬的调节 在缺血缺氧等细胞饥饿状态下, 哺乳动物细胞中mTOR是调节自噬的关键因子。mTOR的活化状态抑制细胞的自噬作用。缺血缺氧使细胞磷酸化水平降低,对自噬的抑制作用减弱[23]。胰岛素等与跨膜胰岛素受体或酪氨酸激酶受体(IR,RTK)结合,激活I型磷脂酰肌醇三磷酸激酶(Class I PI3K),使PIP转化为PIP3,PIP3再结合于Akt/PKB和它的活化分子PDK1。结节性硬化复合物TSC1/2蛋白能抑制mTOR的激酶活性,对自噬发挥正向调节作用。TSC2被AKT磷酸化后,负调节作用减弱,mTOR活性增强。AMPK(AMP活化蛋白激酶)磷酸化TSC2后起相反作用。细胞应激时,AMP/ATP比值增加,AMPK活性增强,磷酸化激活TSC1/2蛋白,从而抑制mTOR、促进自噬形成[24-25]。胰岛素等还可通过激活p38MAPK而抑制自噬,且不依赖于mTOR途径。大多自噬诱导期主要受Ⅰ、Ⅲ型PI3K调节,其中Ⅰ型PI3K的激活可抑制自噬的发生;而Ⅲ型则参与初期自噬体的形成,促进自噬。Ⅲ型PI3K的抑制剂3-MA可以抑制自噬的发生[26]。在生理状态下,这种双向调节保持着动态平衡,自噬被维持在一定的水平,确保了细胞的内环境稳态。但应激条件可能使家族成员对自噬的双重调节失平衡,从而上调或下调自噬水平。
  2.3.2 AMPK对mTOR的抑制作用 AMPK(AMP-activated kinase )是缺血缺氧状态下加强细胞自噬的重要因子,激活的AMPK可通过抑制的mTOR活性而增强自噬。AMPK的活化程度主要受细胞内ATP/AMP比值影响。在应激状态下,AMPK通过抑制mTOR的活性而诱导自噬。当细胞内ATP/AMP比值下降到一定程度时,AMPK被激活,活化的AMPK使TSC2磷酸化并且抑制mTOR的激活因子RHEB[27],由此抑制mTOR活性,使细胞的自噬作用增强。
  2.3.3 Bcl-2、Beclin-1与自噬 Bcl-2家族基因与细胞凋亡有密切的关系,主要有抑制凋亡的Bcl-2,Bcl-xl和促进凋亡的Bax,Bad,Bcl-xs等。Beclin-1是自噬基因,其为自噬的直接执行者。Beclin-1蛋白除了接受自噬信号,还可接受很多其它信号对自噬进行调节,Beclin-1可能是自噬的“守门人”,成为人工干预自噬活性的靶点。研究表明,Bcl-2能抑制Beclin-1依赖性自噬,是缺血缺氧等状态下主要的非mTOR自噬调节途径。Bcl-2可通过抑制Beclin-1依赖性自噬,降低缺血再灌注中的细胞死亡程度。Bcl-2和Bcl-xl能结合到Beclin-1的功能性结构域上,抑制Beclin-1的活性。而Bcl-2家族中的HB3-only蛋白成员如bad等通过破坏Bcl-xl或Bcl-2与Beclin-1相互作用,从而诱导自噬性细胞死亡[28]。Beclin-l和Bcl-2共同参与组成III型PI3复合物调控自噬[29]。Bcl-2主要通过自身磷酸化及去磷酸化发挥对细胞自噬的调节作用,其与c-jun的N末端蛋白激酶JNK1的激活与否有关[30]。
  3 自噬的一般研究方法
  正常细胞自噬活性低,不适于观察,因此,必须对自噬进行人工干预和调节,常用的工具药列举如下。
  3.1 自噬的诱导
   模拟内质网应激剂,如Bredeldin A等;IMPase抑制剂,如Carbamazepine等;制造饥饿剂,如Earle's平衡盐溶液;I型PI3K 通路抑制剂,如N -Acetyl-D-sphingosine;.TOR抑制剂,如Rapamycin;IP3R阻滞剂,如Xestospongin B/C。
  3.2 自噬的抑制
  对自噬体形成的抑制:主要是III 型PI3K通路的抑制剂(如3-MA,被广泛用作自噬的抑制剂)。对自噬体与溶酶体融合的抑制:主要是对自噬体与溶酶体融合过程进行阻断(如巴伐洛霉素A1、长春碱)。对溶酶体降解的抑制:蛋白酶抑制剂(如E64d),对溶酶体的降解进行抑制。
  3.3 自噬的检测
  自噬过程很快,一个自噬体从产生到降解仅需2~3个小时或更短,因此,设置多个检测时间点是非常重要的。
  在透射电镜下可见自噬的全过程[31],它是检测自噬体的金指标。检测自噬体膜上标志性蛋白质:Apg12-Apg5结合体和微管相关蛋白1的轻链3(LC3)。Apg12和Apg5在翻译后就像单个分子一样共价结合在一起,它定位在自噬体双层隔离膜的整个延长阶段。LC3除了定位在自噬体分隔膜上,在自噬溶酶体膜上也可见到[32]。在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成:无自噬时,GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中;自噬形成时,GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜,在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点,一个斑点相当于一个自噬体,可以通过计数来评价自噬活性的高低。利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成:自噬形成时,胞浆型LC3(即LC3-I)转变为(自噬体)膜型(即LC3-II),因此,LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。⑤单丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色法是自噬发生过程中分析分子水平机制的一种非特异的检测自噬体方法[33]。自噬体形成依赖的第二个泛素样结合系统(Apg8)是位于自噬囊泡膜上与MDC特异结合的生化标志,荧光染色后可见核周区域阳性显色。⑥间接自噬体检测法:主要是对脂褐素颗粒的显微观察,自噬体和溶酶体融合后,还有吖啶橙染色法。
  4 结 语
  很多因素能诱导细胞发生自噬,自噬与神经退行性疾病及脑缺血缺氧损伤有密切关系。自噬对应激状态下神经细胞存活、清除神经细胞内衰老细胞器和错误折叠蛋白等起重要作用;其可作为神经细胞的保护机制,也可作为神经细胞死亡方式之一。研究神经细胞自噬及其调节的机理,具有重要的理论价值和现实意义。但神经细胞自噬的信号转导及其对神经细胞生存影响的了解还处于起步阶段。自噬对不同细胞的作用可能不同;相同细胞的自噬作用可能不同;在脑病发生发展的不同阶段,自噬的作用也可能不同。随着对自噬分子机制研究不断的深入,期望通过药物调控神经细胞的自噬水平,从而控制神经系统疾病的发生与发展。

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