阴沟肠杆菌高活性β-内酰胺酶检测与相关耐药表型分析
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作者: 于艳
摘要：目的：通过对阴沟肠杆菌AmpC和ESBL(超光谱β-内酰胺酶)的检测，结合耐药表型机制分析，为临床合理使用药物提供有力的证据。
关键词：阴沟肠杆菌；β-内酰胺酶；AmpC；ESBLs
【中图分类号】R446.5 【文献标识码】A 【文章编号】1672-3783(2012)08-0133-01
1 材料和方法
材料：
1.1 菌株来源：2011年1月至2011年10月从住院患者各类标本中分离的阴沟肠杆菌，选择其中西丁≤三代头孢（头孢他啶、头孢三嗪、头孢噻肟）两种以上中介或耐药的98株作为实验菌株。大肠埃希菌ATCC25922作为三维实验指示菌。实验质控菌株有肺炎克雷伯菌ATCC700603(SHV-18，ESBLs杨型菌株)，大肠埃希菌DH5α产酶株三株，包括TEM-1、SHV-1、ACT-1（质粒型AmpC阴沟肠杆菌O29（野生型AmpC），阴沟肠杆菌O29M（持续高产型AmpC）阴沟肠杆菌1194C（高度诱导型AmpC）。
1.2 药敏纸片及培养基：头孢西丁（FOX）、头孢吡肟（FEP）、头孢三嗪（CRO）、头孢噻肟（CTX）、头孢他啶（CAZ）、哌拉西林/他唑巴坦（PIP/TZS）、MH琼脂、大都胰蛋白肉汤培养基。
1.3 酶抑制剂：克拉维酸（CA）、邻氯西林（CLO）。
2 方法
2.1 酶粗提物的制备：过夜培养的受试菌制成0.5麦氏单位菌液，取50微升加入10毫升大豆胰蛋白肉汤，35℃孵育6小时。4℃3500rpm离心20分钟，沉淀于-20℃冻融8次，加入0.01MPH7.0PBS1.2毫升混匀，4℃1500rpm离心30分钟，取少许上清液做无菌试验，余置-20℃保存，无菌试验阴性，即为酶粗提物。
2.2 头孢西丁三维试验，采用coudron介绍的三维试验方法②，将指示菌涂布MH平板，中央贴FOX纸片，离纸片边缘5mm处由里向外放射状切割一条长10mm的细槽，槽内加40微升酶粗提物，35℃孵育18小时。若狭缝与抑菌圈交接处，提示菌沿抑菌圈边缘以切割槽为中轴，向纸片方向凸起生长，为阳性生长现象，初步判定为产AmpC酶。
2.3 头孢三嗪三维实验及酶抑制试验：试验方法基本同上，中介改贴CRO纸片，四个方向切割四个放射状细槽，槽内分别加入36微升酶粗提物与40微升CLO混合液，36微升酶粗提物与20微升CLO、2微升CA混合液、36微升酶粗提物与4微升生理盐水混合液（对照），35℃孵育18小时。若酶粗提物加盐水出现阳性生长现象，判为β-内酰胺酶阳性，加抑制剂后，阳性生长现象全部消失，为抑制现象阳性向纸片方向凸起缩短为部分抑制。能被CA和CA加CLO混合液抑制，而不被CLO单独抑制，为产ESBLs株；能被CLO和CA加CLO混合液完全抑制，而不被CA单独抑制为产AmpC酶株；仅能被CLO和CA混合液完全抑制为产AmpC酶株和产ESBLs二类酶的菌株。
2.4 药敏实验：采用KB法，进行6种药物敏感实验。
3 β-内酰胺酶分组
Bush1组酶可被CLO(2),按其产酶活力不同可分为野生型（WT），高诱导型（HYP-AmpC）和去阻遏突变型（MU-AmpC）(3)，ESBL属于Bush2，可被CA抑制，不被CLO抑制。其他划为除上述酶以外的各种酶（OTH）。
4 结果
β-内酰胺酶分布:
(1)质控菌株：FOX三维实验中产ACT-1工程株和O29M阳性。CRO三维实验中ACT-1工程株，O29M和ESBLs株阳性，其中ACT-1和O29M可被CLO抑制不被CA抑制，ESBLs可被CA抑制不被CLO抑制，这三株均可被CLO和CA联合抑制。
(2)待测菌株：138株根据三维酶抑制实验可分为6种产酶组合型。有9株菌FOX三维实验向抑菌圈内长1毫米左右，重复实验有时阳性，在CRO三维实验中阳性较FOX三维实验强（向内生长1-3mm），可被CLO完全抑制HYP型。有三株菌FOX、CRO三维实验均阴性，但CRO/CAZ,CTX三种头孢均耐药，改用CTX做三维实验酶检测阳性，所产生的酶可被CA抑制，也可被CLO抑制，在KB法药敏实验中，PIP/TZ为敏感，说明所产生的酶可被TZ抑制，将其化为OTH。
5 结论
随着细菌耐药性的日益增强和复杂化，简单的用药敏感实验数据来判读药敏结果已不能为临床治疗细菌感染作出可靠的预测，因此从细菌耐药机制入手，结合实验表型和治疗经验，已成为当今推断抗生素临床疗效的重要手段。
我们选择头孢西丁耐药或/和两种以上三代头孢≤中介的阴沟肠杆菌作为高活性β-内酰胺酶的检测对象，因为头孢西丁是AmpC酶的诱导物和最佳底物，头孢西丁耐药至少说明细菌中存在可诱导的AmpC基因，而三代头孢的部分耐药更是高活性的β-内酰胺酶存在的标志。
将138株阴沟肠杆菌根据酶实验表型分为6组后，再观察6种抗菌药物表型，其耐药轮廓为阻遏高产AmpC型菌株保持对FEP敏感，而对其余5株均耐药。ESBLs型对FEP和PIP/TZ以敏感为主，三种三代头孢以耐药和中介为主，这种菌株治疗应考虑ESBLs的耐药机制，慎用即使敏感的三代、四代头孢菌素，但他们大多保留对PIP/TZ的敏感性。同时产AmpC和ESBLs两种酶的混合型菌株，三种三代头孢和PIP/TZ均以耐药为主，目前用于临床的加酶抑菌剂类抗生素由于不能抑制AmpC酶，所以对这一类型难以发挥作用。
由于AmpC酶目前尚无更简单的方法，ESBLs纸片扩散法又受AmpC酶存在的干扰，因此对阴沟肠杆菌的常规实验除了应做三代、四代头孢菌素外，应该考虑加做不含CA的抗生素与酶抑制剂的复合型抗生素，如PIP/TZ、头孢哌酮/舒巴坦这样可以为实验室通过表型推测药物提供更多的信息。
参考文献
[1] lindh E，DormbuscK，Julaksk,et al.Antitiotic susceptitility and β-lactamase Prodution in clinical isolates of Enterobacter spp.APMIS，2002,98:462-470
[2] 陈民均.细菌对β-内酰胺酶的耐药性及检测方法.中华检验医学杂志,2002,24（4）：197-200
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