RNA干扰瞬时受体电位阳离子通道1表达抑制缺氧诱导的胶质瘤血管内皮生长因子上调的实验研究

来源:用户上传      作者: 王斌 刘瑶 邹飞

　　[摘要] 目的 探讨瞬时受体电位阳离子通道1（TRPC1）是否参与缺氧诱导的胶质瘤细胞血管内皮生长因子（VEGF）表达。 方法 通过RT-PCR和钙图检测技术观察U87细胞上表达的TRPC亚型；采用RNAi技术、real-time RT-PCR、免疫印迹和ELISA方法，在基因和外分泌蛋白水平观察TRPC1对缺氧U87细胞VEGF表达的影响。 结果 U87胶质瘤细胞表达TRPC1，TRPC3，TRPC4和TRPC5亚型。TRPC通道激动剂OAG增加了胞内Ca2+浓度，而TRPC通道阻断剂2-APB可抑制激动剂诱导的胞内Ca2+浓度增加。化学合成的siRNA-1，siRNA-2和siRNA-3分别减少TRPC1 mRNA到64%，39%和36%（P < 0.01）；分别减少TRPC1蛋白到48%，29%和33%（P < 0.01）。siRNA-2和siRNA-3显著抑制了缺氧诱导的VEGF基因上调（P < 0.01）。同时缺氧U87细胞VEGF蛋白的分泌亦受到抑制（P < 0.01）。 结论 U87胶质瘤细胞表达功能性的TRPC通道，TRPC1参与缺氧诱导的胶质瘤VEGF表达。
　　[关键词] 神经胶质瘤；缺氧；瞬时受体电位阳离子通道1；血管内皮生长因子
　　[中图分类号] Q291 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）06（a）-0004-04
　　神经胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤。低恶性的胶质瘤转化为恶性多形性神经胶质瘤（glioblastoma multiforme，GBM）时，肿瘤出现显著的血管化[1]。大量的血管生成是肿瘤恶性生长的先兆，同时导致大部分患者中位生存时间将不超过50周。抑制GBM的血管生成，对于患者的预后具有重要意义。低氧是引起实体瘤血管生成的重要因素。研究证实，低氧通过激活缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor 1，HIF1），促进血管内皮生长因子（vascular endothelia growth factors，VEGF）的表达与释放，从而导致血管生成[2]。
　　缺氧诱发的胞内钙信号亦参与缺氧反应，如缺氧基因表达。瞬时受体电位阳离子通道（transient receptor potential channels，TRPC）是一类通透Ca2+和Na+的非选择性阳离子通道[3]。近年来研究发现，TRPC通道能感受包括低氧在内的多样性外界刺激[4]。人类细胞表达6个TRPC亚型（TRPC1～TRPC7），除了TRPC2（假基因）。其中，TRPC1广泛表达于多种组织，包括大脑、心脏、平滑肌、内皮、肝脏和睾丸等，发挥重要的生理功能。同时，所有其他TRPC亚型都可和TRPC1组成异源多聚体协同作用[5]。因此，TRPC1通道在TRPC亚型中占有重要地位。研究发现，TRPC1介导了缺氧诱导的肺动脉内皮及平滑肌细胞的增殖[6-7]。然而，TRPC1通道是否参与缺氧反应基因-VEGF的表达，尚不清楚。本研究拟通过RNAi技术探讨TRPC1对缺氧细胞VEGF表达的作用。
　　1 材料与方法
　　1.1 细胞培养
　　人类恶性胶质瘤细胞U87（ATCC）培养于CO2培养箱，常氧条件为21% O2，5% CO2。培养基为DMEM培养基添加10%胎牛血清（invitrogen）。细胞生长至70%～80%时进行传代或接种进行实验。
　　1.2 缺氧处理
　　U87细胞接种36 h后更换为低氧培养基。新鲜培养基于缺氧环境（5% CO2，1% O2，94% N2）预先孵育16～24 h，以造成低氧培养基（氧分压约为43 mm Hg，1 mm Hg=0.133 kPa）。然后迅速放入三气培养箱（forma scientific），环境条件为：5% CO2，1% O2，94% N2，培养至相应时间。
　　1.3 RT-PCR
　　使用Trizol（invitrogen）提取细胞总RNA。运用Oligo 6.0 设计引物，所有引物均跨越两个不同的外显子以避免基因组DNA污染，序列见表1。
　　总RNA反转录产物进行定量PCR扩增（real-time RT-PCR）（SYBR Premix Ex Taq kit，Takara）。扩增条件如下：95℃ 10 s；PCR循环参数：95℃ 15 s，VEGF（59℃）；TRPC1：53℃ 15 s，72℃ 15 s；80℃ 5 s采集荧光，共40个循环。溶解曲线参数：95℃ 60 s，72℃ 30 s，95℃ 30 s，溶解曲线测定全程每隔0.2 s采集SYBR荧光。使用Livak等[8]改良的方法，进行基于内部参照β-actin的定量分析，公式如下：
　　F（倍数）=2-△△CT，△△CT=（CT.Target-CT.Actin）treated-（CT.Target-CT.Actin）control，
　　其中，（CT.Target-CT.Actin）treated：处理组靶基因CT值与内参CT值的差；（CT.Target-CT.Actin）control：对照组靶基因CT值与内参CT值的差。PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，在凝胶成像系统进行成像。
　　1.4 免疫印迹
　　使用RIPA全细胞裂解液提取U87细胞总蛋白。Lowry法进行蛋白定量。等量蛋白样品进行SDS-凝胶电泳，后转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。室温下，含5%牛血清蛋白（BSA）的TBST缓冲液封闭膜2 h。将一抗用含3%BSA的TBST缓冲液稀释至适当浓度，TRPC1一抗（1∶2000），β-actin一抗（1∶2000），4℃摇床孵育过夜。洗涤后将膜与二抗（1∶5000）室温孵育1 h。使用增强化学发光法（ECL法）暗室显影。 　　1.5 钙图检测与分析
　　U87细胞接种于激光共聚焦培养皿，培养24 h后测定胞内钙离子浓度。细胞与10 μmol/L fluo-3/AM避光37℃孵育30 min后用羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPEs）液漂洗3次。最后，加入含钙HEPEs液。实验步骤如下：首先加入100 μmol/L OAG，通过ASAS570激光共聚焦显微镜连续监测胞内钙浓度变化。待胞内钙浓度升高到一个稳定的平台时，加入2-APB，继续监测钙浓度的变化。激光共聚焦显微镜使用的激发光为488 nm，发射光为530 nm，扫描间隔1107 ms。实验共选择14个形态正常的细胞进行荧光监测，数据用ACAS570-IQ分析软件分析，并用Origin 7.0作图。
　　1.6 ELISA分析
　　缺氧24 h后，收集各组培养基上清。设定空白孔，分别取稀释的上清样品和标准品100 μL加入酶标板中，37℃孵育90 min；洗涤3次；每孔加入生物素标记人VEGF抗体100 μL，37℃孵育60 min；洗涤3次；除空白孔外，每孔加入亲和素-过氧化物酶复合物100 μL，37℃孵育30 min；洗涤4次；加入四甲基联苯胺（TMB）显色液100 μL，37℃反应15 min；加入终止液混匀后立即测量波长450 nm吸光度值。标准品数据用SPSS拟合浓度-吸光度值曲线回归方程，并据此计算各样品VEGF浓度。
　　1.7 RNA干扰实验
　　接种细胞于6孔板，24 h后达到15%～20%汇合度通过lipofectamine 2000进行转染。转染6 h后，细胞在完全生长培养基中培养48 h（real-time RT-PCR检测TRPC1 mRNA干扰效率）和60 h（蛋白水平检测干扰效率以及进一步的缺氧处理）。SiRNA正义链序列如下：NC siRNA：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT；siRNA-1：GGAUGUGCGGGAGGUGAAGTT；siRNA-2：GGUCCAUUACAGAUUUCAATT；siRNA-3：CAGGUGACUUGAACAUAAATT。NC：negative control，siRNA实验的对照。常氧NC组：正常培养的NC组。
　　1.8 统计学方法
　　采用统计软件SPSS 13.0对数据进行分析，Origin 7.0处理分析并作图；正态分布计量资料的多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 U87细胞表达功能性的TRPC通道
　　给予TRPC通道激动剂OAG，胞内Ca2+浓度先迅速升高后缓慢下降并保持于一高Ca2+平台期。在平台期进一步给予TRPC通道抑制剂2-APB（2-aminoethoxydiphenyl borate）后，Ca2+浓度迅速下降（图1A）。提取常氧下U87细胞总RNA，进行常规RT-PCR扩增TRPC基因，琼脂糖凝胶电泳检测到4个单一条带，大小为168 bp，112 bp，119 bp，159 bp（与预期的产物大小一致），分别对应于TRPC1，TRPC3，TRPC4和TRPC5亚型（图1B）。
　　2.2 RNAi下调TRPC1表达
　　分别使用3个针对TRPC1不同编码区位置的化学合成的siRNAs转染细胞。转染后48 h，real-time RT-PCR显示，相对于阴性对照siRNA（NC）组，siRNA-1，siRNA-2和siRNA-3分别减少TRPC1 mRNA到到NC组的64%，39%及36%（F = 15.39，P = 0.001）（图2A）。转染后60 h，3个siRNAs分别减少TRPC1蛋白到NC组的48%，29%及33%（F = 21.336，P = 0.000）（图2B和2C）。
　　2.3 RNAi下调TRPC1对缺氧细胞VEGF表达的作用
　　图3A显示，siRNA-2和siRNA-3显著减弱了缺氧诱导的VEGF基因上调（F = 29.153，P = 0.000）。进一步通过ELISA检测细胞培养基中的VEGF发现，siRNA-2和siRNA-3抑制了缺氧24 h诱导的VEGF蛋白分泌（F = 13.745，P = 0.000）（图3B）。
　　3 讨论
　　低氧微环境是GBM的显著特征，其靶细胞位于GBM瘤体坏死灶的周围区域[9]。这些细胞高度缺氧，生成并释放大量VEGF，导致新生血管生成，促进肿瘤恶性进展[10]。因此研究能调控缺氧胶质瘤VEGF生成释放的信号通路、寻找抗血管生成治疗新靶点具有重要临床意义。
　　质膜离子通道能感受低氧变化，通过钙信号来调控缺氧反应。已有研究证实，钾通道、非选择性阳离子通道参与缺氧基因表达。TRPC通道是一类非选择性阳离子通道，是近期的研究热点。然而是否TRPC通道参与胶质瘤缺氧反应基因-VEGF表达尚不清楚。人类细胞共表达6个TRPC亚型。本文首先联合使用钙图和RT-PCR，发现U87胶质瘤细胞表达功能性的TRPC1，TRPC3，TRPC4和TRPC5亚型，其中TRPC1表达量最高。此外，研究报告认为，TRPC1主要通过和其他TRPC亚型组成异源多聚体而发挥功能[11]。因此，进一步选择TRPC1为靶分子，通过RNAi技术阐明其对缺氧诱导的VEGF表达的影响。结果显示，siRNA-2和siRNA-3显示出较好的干扰效率，TRPC1 mRNA水平分别下降61%和64%，蛋白水平分别可降低71%和67%。更为重要的是，干扰TRPC1表达抑制了缺氧U87细胞VEGF基因表达。同时分泌于培养基中的VEGF蛋白缺氧反应性上调也受到抑制。这些数据表明，缺氧U87细胞VEGF表达反应中，TRPC1起着重要作用。这为胶质瘤抗血管生成治疗提供了新的研究方向。 　　TRPC1通道激活后，引发胞内Ca2+升高。而VEGF主要受到转录因子HIF1和AP1的调控。近期研究表明，胞内钙信号既可能影响经典的缺氧-HIF1α-VEGF通路[12]，亦可能通过AP1-VEGF通路而发挥作用[13]。此外，HIF1α和AP1通路存在协同作用。因此，下一步研究工作将着力阐明TRPC1的下游信号通路，为胶质瘤血管生成新机制提供更充足的理论依据。
　　[参考文献]
　　[1] Plate KH，Scholz A，Dumont DJ. Tumor angiogenesis and anti-angiogenic therapy in malignant gliomas revisited [J]. Acta Neuropathol，2012，124（6）：763-775.
　　[2] 徐士欣，张军平，仲爱芹，等.缺氧诱导因子-1α在脑缺血性损伤中作用机制的研究进展[J].中华神经医学杂志，2012，11（2）：203-204.
　　[3] Vennekens R，Menigoz A，Nilius B. TRPs in the Brain [J]. Rev Physiol Biochem Pharmacol，2012，163：27-64.
　　[4] Chu W，Wan L，Zhao D，et al. Mild hypoxia-induced cardiomyocyte hypertrophy via up-regulation of HIF-1alpha-mediated TRPC signalling [J]. J Cell Mol Med，2012，16（9）：2022-2034.
　　[5] Shi J，Ju M，Abramowitz J，et al. TRPC1 proteins confer PKC and phosphoinositol activation on native heteromeric TRPC1/C5 channels in vascular smooth muscle：comparative study of wild-type and TRPC1-/-mice [J]. FASEB J，2012，26（1）：409-419.
　　[6] Lin MJ，Leung GP，Zhang WM，et al. Chronic hypoxia-induced upregulation of store-operated and receptor-operated Ca2+ channels in pulmonary arterial smooth muscle cells：a novel mechanism of hypoxic pulmonary hypertension [J]. Circ Res，2004，95（5）：496-505.
　　[7] Wang J，Weigand L，Lu W，et al. Hypoxia inducible factor 1 mediates hypoxia-induced TRPC expression and elevated intracellular Ca2+ in pulmonary arterial smooth muscle cells [J]. Circ Res，2006，98（12）：1528-1537.
　　[8] Livak KJ，Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-（Delta Delta C（T））Method [J]. Methods，2001，25（4）：402-408.
　　[9] Damert A，Machein M，Breier G，et al. Up-regulation of vascular endothelial growth factor expression in a rat glioma is conferred by two distinct hypoxia-driven mechanisms [J]. Cancer Res，1997，57（17）：3860-3864.
　　[10] 曹文军，刘致中.Suvivin和VEGF在前列腺癌组织中的表达及相关性研究[J].中国医药导报，2012，9（28）：21-23.
　　[11] Song MY，Yuan JX. Introduction to TRP channels：structure，function，and regulation [J]. Adv Exp Med Biol，2010，661：99-108.
　　[12] Li J，Zhao SZ，Wang PP，et al. Calcium mediates high glucose-induced HIF-1 alpha and VEGF expression in cultured rat retinal Muller cells through CaMKⅡ-CREB pathway [J]. Acta Pharmacol Sin，2012，33（8）：1030-1036.
　　[13] Muller I，Lipp P，Thiel G. Ca2+ signaling and gene transcription in glucose-stimulated insulinoma cells [J]. Cell Calcium，2012，52（2）：137-151.
　　（收稿日期：2013-01-28 本文编辑：李继翔）
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