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等位基因特异性PCR在ACE基因多态性检测中的应用

来源:用户上传      作者: 胡月新 徐天勇

  【摘要】 目的:采用等位基因特异性PCR法对ACE基因多态性进行检测,并对脑血管疾病(CVD)与ACE基因多态性的相关性进行探讨。方法:将2010年2月-2013年2月云南景颇族和傣族共73例CVD患者(CVD组)和43例健康人员(对照组)进行ACE基因多态性检测,并对结果进行分析。结果:116例受检人员均获得扩增产物,CVD组患者73例扩增产物中,DD型14例(19.2%),II型30例,ID型29例;对照组43例扩增产物中,DD型5例(11.6%),II型19例,ID型19例,对照组中DD型基因频率低于CVD组,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:等位基因特异性PCR检测技术可对ACE基因多态性进行有效检测,对于CVD的防治具有重要的参考意义。
  【关键词】 等位基因特异性PCR; 脑血管疾病; ACE基因多态性
  中图分类号 R743 文献标识码 B 文章编号 1674-6805(2013)34-0042-02
  脑血管疾病(cerebrovascular disease,CVD)由脑血管病变所引起,主要高发于65岁以上人群,患者发病后易残留后遗症,导致劳动和生活能力丧失,也是人类死亡的重要原因之一。CVD主要分为缺血性脑血管病和出血性脑血管病,其中以缺血性为多见。CVD的产生由遗传因素和环境因素共同作用所引起,高血压、糖尿病、动脉粥样硬化等疾病是CVD发生的首要高危因素[1],而血管紧张素转换酶(ACE)基因多态性与高血压等心血管疾病的发生有关[2]。笔者选择等位基因特异性PCR技术对云南景颇族和傣族73例CVD患者的ACE基因多态性进行检测,以期为ACE基因多态性与CVD的相关性提供临床依据,现将结果报道如下。
  1 资料与方法
  1.1 一般资料
  选取2010年2月-2013年2月云南景颇族和傣族46例健康人员(对照组)和73例CVD患者(CVD组),取早晨空腹静脉血10 ml,肝素抗凝后离心分离血浆,采用酚抽提法抽提患者外周血白细胞DNA模板,所有受检人员无血缘关系。
  1.2 试剂与仪器
  DNA提取试剂选用天根DP-318 DNA提取试剂盒;Taq master等PCR反应试剂购自天根生化科技有限公司;引物由捷瑞生物工程(上海)有限公司合成,ACE-F,5’-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3’,ACE-R,5’-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3’;PCR仪选用Icyclertm thermal cycler(美国Bio-RAD公司);微量核酸蛋白定量仪选用ND-1000 UV/Vis(美国NanoDrop公司);凝胶成像系统选用Universal HoodII(美国Bio-RAD公司)。
  1.3 方法
  1.3.1 模板DNA提取 在全血样品中加入Prok 20 μl,完全混合、离心,再加入GB 200 μl,离心后加无水乙醇,充分混合后过柱,弃滤液,加入TB 50 μl,过柱后回收TB定量,并对DNA样品进行含量检测。
  1.3.2 PCR反应体系和反应条件 扩增体系:ACE-F或ACE-R引物1.5 μl,H2O 7.5 μl(样品),2×Taq-master 10 μl,DNA样品1 μl。PCR扩增条件:94 ℃×4 min预变性,94 ℃×30 s变性,67 ℃×30 s退火,72 ℃×30 s延伸,共28~31个循环,72 ℃×4 min延伸后保存。采用凝胶成像系统对扩增产物进行分析,所有样品的PCR实验以及电泳分析均重复两次以上以对结果进行验证。
  1.4 统计学处理
  采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析,计量资料用均数±标准差(x±s)表示,比较采用t检验;计数资料以率(%)表示,等位基因频率差异采用字2检验,P<0.05为差异有统计学意义。
  2 结果
  2.1 基因组DNA提取
  116例全血标本经DNA提取后对含量进行检测,CVD组DNA纯度为1.55~2.10,对照组DNA纯度为1.47~2.04,均符合后续实验要求。
  2.2 等位基因特异PCR分型结果
  116例标本均得到扩增产物,且分为3型:缺失纯合子型(DD型),PCR扩增产物为190 bp;插入纯合子型(II型),PCR扩增产物为490 bp;两种片段并存则为杂合子型(ID型)。其中CVD组患者73例扩增产物中,DD型14例(19.2%),II型30例,ID型29例,对照组43例扩增产物中,DD型5例(11.6%),II型19例,ID型19例,对照组中DD型基因频率低于CVD组,差异无统计学意义(字2=1.13,P>0.05),所有样品均经两次以上PCR及电泳验证,条带均清晰且结果一致(图1)。
  DL 2000 490 bp(II型) 190 bp(DD型) (ID型)100 bp DNA Ladder
  图1 ACE基因多态性等位基因特异性PCR检测结果
  3 讨论
  脑血管疾病(CVD)是65岁以上人群的常见疾病,当患者脑部出现梗阻性缺血时即发生缺血性CVD,而当脑部血管发生破裂时则为出血性CVD,患者易致残致死,丧失工作或生活能力,危险性极高[3]。有研究表明,脑血管疾病的发生与高血压、高血脂、高血糖、冠心病等心血管疾病密切相关,而ACE基因中由Alu重复序列的存在或缺失的三种基因型(缺失纯合子DD,插入纯合子II,杂合子ID)与心血管疾病的发生有关[4]。因此,鉴于CVD的高发性和危害性,ACE基因多态性的检测对于CVD疾病的防治具有重要的意义。
  在本次研究中,116例受检人员均成功得到扩增产物,且经验证结果一致。在CVD组73例患者的扩增产物中,DD型14例,基因频率19.2%;对照组43例患者的扩增产物中,DD型5例,基因频率11.6%,明显低于CVD组,提示CVD与ACE基因DD型有关,与相关研究相符[5]。同时有研究表明,ACE基因DD型会影响高血压疾病的早期发生,也是心肌梗死发病和左心室肥厚的独立危险因素[6]。等位基因特异性PCR作为一种基因突变的测定方法,具有用时短、操作简便、价格低廉等优点,与PCR-RELF方法相比省去了酶切步骤,也可避免酶切过程中的影响因素,有效提高检测准确性的同时可降低费用。
  综上所述,ACE基因多态性的基因型检测对于CVD的防治具有一定的参考意义,而等位基因特异性PCR是对基因多态性进行检测的有效方法。
  参考文献
  [1]张啸飞,胡大一,丁荣晶,等.中国心脑血管疾病死亡现况及流行趋势[J].中华心血管病杂志,2012,40(3):179-187.
  [2]Holman E A.Acute stress and cardiovascular health:is there an ACE gene connection[J].J Trauma Stress,2012,25(5):592-597.
  [3]尚青华,徐浩.心脑血管疾病危险评估方法学研究进展[J].中华老年医学杂志,2011,30(5):436-438.
  [4]陈秀梅,卢新政.ACE基因I/D多态性在心血管疾病中的研究进展[J].国际遗传学杂志,2008,31(6):471-474,482.
  [5]龚洁,丁新生,陈其元,等.脑卒中患者血管紧张素转换酶基因缺失多态性分析[J].南京医科大学学报(自然科学版),2005,25(12):890-893.
  [6]Ruey-Yun Wang,Chia-Min Chung,Cathy S J Fann,et al.Genome-wide scan for quantitative ACE activity in Taiwan young-onset hypertension study[J]. Human heredity,2008,65(2):85-90.
  (收稿日期:2013-08-13) (编辑:程旭然)
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