微柱凝胶法在不规则抗体特异性鉴定中的应用

来源:用户上传      作者: 粟明丽

　　【摘要】 目的：探讨微柱凝胶法在血型不规则抗体特异性鉴定中的应用。方法：分别用盐水法、抗人球蛋白法、微柱凝胶法对笔者所在医院64例不规则抗体阳性患者进行抗体特异性鉴定。结果：盐水法检出2例抗体，抗人球蛋白法检出55例抗体，微柱凝胶法检出62例抗体。其中Rh系统抗体24例，MNSs系统11例，Lewis系统9例，Diego系统2例，抗-E联合抗-Mur 1例，未确认抗体特异性17例。结论：微柱凝胶法应用于不规则抗体特异性鉴定敏感性高、特异性强，操作简便、快捷，结果判读清晰易于标准化。
　　【关键词】 微柱凝胶法； 抗人球蛋白法； 不规则抗体； 抗体特异性
　　不规则抗体是指抗A、抗B以外的血型抗体，在临床上易引起输血不良反应、新生儿溶血病、血型鉴定及交叉配血困难等。输血前对受血者进行血型不规则抗体筛选、特异性鉴定及交叉配血试验，是确保临床输血安全和有效的重要措施。笔者所在医院采用盐水法、抗人球蛋白法、微柱凝胶法对拟输血和手术的患者进行血型不规则抗体筛选，对结果阳性者再进行抗体特异性鉴定，为患者选择相应抗原阴性及交叉配血试验相合的血液进行输注，保证了临床输血治疗的安全性和有效性。
　　1 材料与方法
　　1.1 一般资料 选自笔者所在医院2012年10月-2014年2月住院申请输血和手术备血的7596例患者筛查出的不规则抗体阳性64例，年龄26～85岁，男16例，女48例，有输血史或妊娠史者52例，无输血史或妊娠史者12例。
　　1.2 方法
　　1.2.1 仪器与试剂 全自动血型与配血分析系统（强生公司）；Diana微柱凝胶抗球蛋白卡、低离子介质溶液、专用孵育器、离心机（西班牙黛安娜公司）；KA-2200离心机（日本九保田公司）；上海产的电热恒温水浴箱。抗人球蛋白试剂、抗体筛选细胞、谱细胞、抗M抗体、抗P1抗体、抗C抗体、抗c抗体、抗D抗体、抗E抗体、抗e抗体、2-Me试剂（上海血液生物医药有限责任公司）；试剂均批检合格并在有效期内使用。
　　1.2.2 不规则抗体的筛查 取患者EDTA二钾盐抗凝血标本4 mL，未抗凝标本4 mL，3000 r/min离心5 min后，采用盐水介质（室温、4 ℃、37 ℃）和微柱凝胶抗球蛋白法同时检测参照文献[1]，全自动分析系统检测出的阳性结果再用Diana微柱凝胶抗球蛋白卡复查。
　　1.2.3 不规则抗体特异性鉴定
　　1.2.3.1 盐水法和抗人球蛋白法 在11支试管内分别加入1至10号谱细胞及洗涤三次的2%～5%自身细胞悬液各1滴，各加入被检者血清2滴，混匀，分别置室温、4 ℃、37 ℃下离心观察并记录结果，后置37 ℃孵育1 h，用生理盐水洗涤3次，倒尽末次洗涤的盐水，吸干试管边缘的水分，于试管内加入抗人球蛋白试剂2滴，3000 r/min离心15 s，观察结果，有凝集者为阳性，无凝集者为阴性；同时用IgG抗D致敏的2%～5%的O型RhD阳性压积红细胞做阳性对照，AB血清2滴加2%～5%的O型RhD阳性压积红细胞做阴性对照。
　　1.2.3.2 微柱凝胶法 在微柱凝胶卡上标记被检者姓名及谱细胞的编号、自身细胞，用微量加样器分别加入低离子液稀释的0.8%～1%的谱细胞悬液、自身细胞悬液各50 μL，后加被检者血浆25 μL于微柱凝胶卡中，置37 ℃专用孵育器内孵育15 min，1100 r/min离心9 min，肉眼观察结果。红细胞均匀沉于管底者为阴性，悬浮于凝胶表面或凝胶中段者为阳性。根据实验结果对照标准细胞谱确定抗体的特异性。对鉴定为特异性抗体者，采用相对应的抗体试剂检测红细胞抗原是否为阴性，以确认所检抗体的准确性。
　　1.2.4 不规则抗体免疫球蛋白类别鉴定方法 采用巯基试剂（2-Me）区分IgG和IgM技术。
　　1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，检验采用配对计数资料的 字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 3种方法对血型抗体特异性鉴定结果 64例不规则抗体阳性患者，盐水法检出特异性抗体2例，抗人球蛋白法检出55例抗体，微柱凝胶法检出62例抗体。抗人球蛋白法和微柱凝胶法两者比较差异有统计学意义（P<0.05）。
　　2.2 不规则抗体特异性分布 64例不规则抗体阳性患者中Rh系统抗体24例，MNSs系统11例，Lewis系统9例，Diego系统2例。抗D 3例、抗Ec 11例、抗E 9例、抗M 7例、抗 Lea 8例，抗Mur、抗Dia各2例，抗c、抗N、抗Leb、抗s各1例，抗-E联合抗-Mur 1例，未确认抗体特异性17例。
　　3 讨论
　　不规则抗体分为IgM和IgG类抗体，IgM抗体是天然产生的，IgG抗体是通过妊娠免疫、注射、异型输血等刺激产生的，其分子量小可通过胎盘引起新生儿溶血病及输血不良反应。输血前常规检查不规则抗体并进行抗体特异性鉴定对保障安全输血至关重要。目前用于抗体特异性鉴定的方法有盐水法、凝聚胺法、抗人球蛋白法、微柱凝聚法等。盐水法用于检测IgM类抗体，在4 ℃反应最强，37 ℃减弱，为了避免冷凝集干扰分别置室温、4 ℃、37 ℃三种温度下检测。本实验中盐水法检出的2例抗M抗体，凝聚胺法、抗人球蛋白法、微柱凝胶法均为阴性。
　　凝聚胺法易受到冷凝集素、肝素的影响，不能检出Kell血型系统的抗-K抗体，判读结果时间短需在1 min之内看结果、易受振摇力度的影响，凝集用力振摇或放置时间稍长可能消失，对抗E抗体漏检[2]，对低浓度抗体不能检出[3]，抗人球蛋白法和微柱凝胶法无法确定抗体特异性的再用凝聚法复检，本实验中无一例凝聚胺法检测阳性其他方法检测阴性的患者，它适用于急诊抢救患者的交叉配血。
　　抗人球蛋白法较为经典，技术要求高，操作时间长，繁琐，需要洗涤细胞，易受人为因素的影响，此方法检出阳性特异性抗体55例，有7例微柱凝胶法阳性患者抗人球蛋白法检测为阴性，经检验两者差异有统计学意义（P<0.05）。 　　微柱凝胶法是血型血清学方法的一项新的免疫学检测技术，通过微柱凝胶的微孔过滤作用和抗原抗体特异性反应作用，经低速离心后，利用微柱凝胶层析分子排阻原则将发生凝集反应的红细胞阻滞于凝胶上层，呈阳性，而游离的单个红细胞，则穿过微孔到达凝胶底部，呈阴性反应，广泛用于血型鉴定，交叉配血试验，不规则抗体筛查，直接抗人球蛋白试验等，对自身免疫性溶血性贫血（AIHA）的诊断具有重要价值[4]。其灵敏度高于抗人球蛋白法[5-9]，特异性强，操作标准化，简便，快捷，标本用量少，结果判读清晰，可照相存档，省去抗人球蛋白法洗细胞的麻烦，缺点就是成本高，对多发性骨髓瘤及巨球蛋白血症患者由于血清中产生大量M蛋白包裹红细胞，易于聚集呈缗钱样改变，产生假凝集[10]，需用抗人球蛋白法检测。细胞悬液浓度需严格控制在0.8%～1%，否则易出现假阴性或假阳性。此方法检出特异性抗体62例，有2例抗Ec联合抗体用抗人球蛋白法检测为抗E，漏检抗c。
　　64例不规则抗体特异性分布中Rh系统所占比例最高，Rh血型抗体主要通过输血或妊娠免疫产生的免疫性IgG抗体，是引起免疫性溶血性输血反应和新生儿溶血症最常见的不规则抗体[11-13]，重要性仅次于ABO血型系统，本实验中大多数为女性患者和有输血史/妊娠史患者，接受免疫刺激的机会多，所产生的抗体比率高。如输血科条件允许可做Rh系统分型，选分型相同的血液进行输注，可避免产生Rh系统抗体。MNSs系统、Lewis系统的抗体多数是天然产生的IgM抗体，少数为IgG抗体。抗M、抗N 抗体仅在抗球蛋白试验阳性或37 ℃时才有临床意义，能引起新生儿溶血病。Diego系统中Dia的抗原频率低，检出的抗体少。抗-Dia亦能引起新生儿溶血病。Lewis系统中抗Lea所占比例最高8例，抗-Lewis抗体多数是IgM型，在37 ℃抗人球蛋白实验中有反应，此反应比室温时的反应弱。未确定特异性抗体占26.56%，其原因有：（1）自身抗体和同种抗体同时存在；（2）是几种抗体联合在一起无法辨别；（3）抗体减弱与谱细胞格局不符；（4）有低频率抗原的可能；（5）自身抗体比如红斑狼疮、自身免疫性溶血性贫血引起的[14-15]。
　　综上所述，对拟输血和手术的患者常规进行血型不规则抗体筛选，对结果阳性者再用盐水法、微柱凝胶法进行抗体特异性鉴定，未确定抗体特异性者用抗人球蛋白法和凝聚胺法复检，有利于早期发现和确认具有临床意义的抗体，以使抗体阳性的患者在术前尽早获得相配合的血液，确保输血安全。同时对有输血史或妊娠史的孕妇做产前抗体筛查，检出血型不规则抗体，降低新生儿溶血症的发生率。
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　　（收稿日期：2014-05-13） （本文编辑：石亚飞）
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