人胆囊癌裸鼠移植瘤模型的建立及超声观察

来源:用户上传      作者: 陈娟 张炎晶 苗燕 赵育芳 刘利平

　　[摘要] 目的 建立人胆囊癌裸鼠皮下移植瘤模型，并对其进行超声观察。 方法 培养GBC-SD细胞，将细胞浓度调至1×107/ml，取0.2 ml注射于裸鼠皮下。成瘤后作为瘤源，瘤块剪成约2 mm3的组织块，置入裸鼠皮下，待其成瘤。以后各代模型的瘤源均来自上一代模型，用同样的方法接种。记录瘤块成瘤率、成瘤时间、生长特点。观察瘤块外观，并进行超声、解剖及病理观察。 结果 细胞注射法及组织块法可成功建立胆囊癌裸鼠移植瘤模型，成瘤率为100%；各代组织块法之间成瘤时间差异无统计学意义（P>0.05）；二维超声测量瘤体最大径与大体游标卡尺测量差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 将细胞注射法与组织块法结合，是一种理想的建立人胆囊癌裸鼠移植瘤模型的实验方法。
　　[关键词] 胆囊癌；裸鼠；移植瘤；动物模型
　　[中图分类号] R735.8 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）02（b）-0004-04
　　Establishment of human gallbladder cancer nude-mouse transplanted tumor model and its ultrasonic observation
　　CHEN Juan ZHANG Yan-jing MIAO Yan ZHAO Yu-fang LIU Li-ping▲
　　Department of Ultrasound，the First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030000，China
　　[Abstract] Objective To establish the human gallbladder cancer nude-mouse transplanted tumor model and to observe by ultrasound. Methods GBC-SD cells were cultured and the cell concentration was adjusted to 1×107/ml，of which 0.2 ml was subcutaneously injected to nude mouse.The cultivated tumor was selected as the tumor source and cut into tissue blocks of 2 mm3，which were then implanted into the subcutaneous tissue of nude mouse to cultivate tumor.The tumors of later generation were all cultivated from sources of tumors of the former generation by the same method.The tumor formation rate，time of tumor formation，and features of tumor formation were recorded.The appearance of tumor block was observed and ultrasonic，anatomical and pathological observations were conducted. Results The method of cell injection and tissue block implantation could successfully establish the gallbladder cancer nude-mouse transplanted tumor model，with tumor formation rate of 100%.The tumor formation time of each generation showed no statistically significant difference （P>0.05）.The maximum diameter of tumor detected by ultrasound and vernier caliper showed statistically significant differences （P<0.05）. Conclusion Combination of cell injection and tissue block implantation is a favorable method to establish the gallbladder cancer nude-mouse transplanted tumor model.
　　[Key words] Gallbladder cancer；Nude mouse；Transplanted tumor；Animal model
　　胆囊癌是胆道系统恶性肿瘤中最常见的一种类型，占消化道恶性肿瘤的第5位[1]。近年来，胆囊癌的发病率有逐渐增高的趋势，且早期原发性胆囊癌无特异性的临床表现，临床发现的胆囊癌多为中晚期，根治性切除率低，治疗效果及预后差[2-4]。因此建立合适的动物模型是研究胆囊癌体内生长、转移机制的重要工具，对胆囊癌的早期诊断、治疗及有效评估治疗效果、预后等有深远意义。本研究将GBC-SD细胞注射法和瘤组织块法结合，成功建立了裸鼠移植瘤模型，现报道如下。
　　1 材料与方法
　　1.1 细胞培养
　　GBC-SD人胆囊癌细胞购自中国科学院细胞库，细胞株从一位61岁的男性低分化胆囊癌患者中建立。细胞培养于含10%胎牛血清（杭州四季青公司），0.4%双抗的RPMI1640（Gibco公司）培养基中，置于培养箱中连续培养及传代，培养箱温度保持在37℃，培养环境为5.0%CO2，1～2 d换液1次，细胞处于对数生长期时用胰酶消化后收集，加入适量生理盐水调整细胞悬液浓度至1×107/ml，置于1 ml的EP管中备用。 　　1.2 实验动物
　　BALB/c裸鼠33只，购自常州卡文斯实验动物有限公司，鼠龄3～4周，雄性，体重16～18 g，饲养于山西医科大学实验动物中心，实验条件符合SPF要求，所用物品均经高压灭菌消毒。裸鼠置于恒温、恒湿、无菌、净化的屏障系统内饲养。
　　1.3 细胞注射行裸鼠皮下移植瘤模型的制备
　　随机取其中2只裸鼠，10 ml/kg 5%水合氯醛腹腔注射麻醉，碘伏消毒右前肢皮肤，用1 ml注射器吸取0.2 ml细胞悬液注射于右前肢皮下。观察裸鼠移植部位，了解肿瘤生长情况及生长速度。
　　1.4 组织块法行裸鼠皮下移植瘤模型的制备
　　细胞注射接种，皮下瘤块达成瘤标准（瘤块直径约1.0 cm）后，作为瘤源，无菌条件下取出瘤块，去除脂肪、坏死组织及纤维组织，取边缘活力旺盛的组织用无菌生理盐水漂洗，眼科剪剪成约2 mm3的组织块放入盛有生理盐水的培养皿中备用。另取裸鼠7只，消毒双前肢下皮肤，用眼科剪剪开2～4 mm长的小口，将备好的小瘤块2～3块置入皮下，缝合皮肤，消毒切口周围，青霉素肌内注射3 d，种瘤3 d后拆线。观察裸鼠移植部位，了解肿瘤生长情况及生长速度。
　　待前一代裸鼠移植瘤达成瘤标准后，任选一只作为瘤源，用同样的组织块法进行下一轮接种传代，制备皮下移植瘤模型，第二代种瘤9只，18个瘤块，第三代种瘤15只，30个瘤块。以后各代模型的瘤源均来自上一代模型。
　　1.5 瘤块的超声检查
　　外观游标卡尺所测最大径达1 cm后，超声观察其特点。用GE Logic E9超声诊断仪，ML6～15线阵宽频探头观察，实验中显像深度基本保持一致，图像增益、声压、机械指数均保持不变。
　　1.6观察项目
　　1.6.1 裸鼠移植瘤生长情况及生长速度 观察裸鼠的健康状态、一般情况及皮下肿瘤形成情况，种瘤后每2天用数字游标卡尺测量皮下瘤的最大径。记录不同成瘤方法的成瘤时间及成瘤率。
　　1.6.2 瘤块超声 常规超声扫查瘤块，观察记录瘤块大小、回声及血流特征。
　　1.6.3 瘤块的病理学检查 实验完成后处死裸鼠，完整切取肿瘤组织，标本常规10%甲醛固定，脱水、石蜡包埋、切片，行HE染色，光镜下观察。
　　1.7 统计学分析
　　采用统计软件SPSS 16.0对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组独立样本的比较采用方差分析，单样本均数的比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 成瘤率的统计情况
　　人胆囊癌细胞GBC-SD接种裸鼠2只，均成瘤，成瘤率100%。第一代组织块法接种裸鼠7只，每只2个，7只裸鼠14个均成瘤，成瘤率为100%。第二代组织块法接种裸鼠9只（18个），其中一只裸鼠因实验疏忽漏喂水而死亡，剔除实验，其余8只（16个）裸鼠均成瘤，成瘤率为100%。第三代组织块法接种裸鼠15只（30个），均成瘤，成瘤率为100%。
　　2.2 瘤体生长特点及成瘤时间
　　细胞注射组及瘤组织块组种瘤6 d后，接种部位陆续开始出现瘤块。后瘤块缓慢增大，瘤块最大径达4 mm后，生长速度逐渐加速。
　　细胞注射组皮下瘤块最大径达1 cm的时间为（16.5±0.7）d。第一代组织块法组、第二代组织块法组、第三代组织块法组皮下瘤块最大径达1 cm的时间分别为（17.1±2.1）、（17.5±1.9）、（17.6±1.6）d。组织块法各代之间瘤块最大径达1 cm的时间，差异无统计学意义（P>0.05）。
　　2.3瘤体观察
　　2.3.1 外观观察 瘤体质硬，固定于肢体皮下，膨胀性生长，呈类球形，与周围组织分界清楚，易剥离，晚期部分瘤体处皮肤可见破溃。
　　2.3.2 超声观察 瘤体呈低回声，内部回声均匀或不均匀，与周围皮肤分界清楚，随着瘤块增大，中央可呈无回声。彩色多普勒血流显像可见部分瘤块内有点状、线状或分支状彩色血流信号（图1）。二维超声所测瘤块最大径为（0.88±0.09）cm，小于外观游标卡尺所测值1 cm，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　图1 组织块法瘤块超声观察
　　2.3.3 解剖观察 瘤体苍白，质硬，切开后，中间红色质软，有坏死组织，周围是活跃的肿瘤细胞层，肿瘤的外层包裹有包膜（图2）。
　　图2 组织块法瘤块解剖观察
　　2.4 病理切片观察
　　瘤块病理切片HE染色细胞形态符合人胆囊癌的特征。瘤体组织内细胞排列紊乱，内有大量分化程度低，形状不规则、大小不一，胞质丰富的深染巨核细胞，细胞核异形性明显，同时可见少量核分裂象及多核瘤巨细胞（图3）。
　　图3 瘤块病理切片（HE，×400）
　　3 讨论
　　原发性胆囊癌是胆道系统最常见的恶性病变，占消化道恶性肿瘤的第5位[1]，胆囊癌恶性程度高，侵袭能力强，手术切除率低，辅助治疗效果不佳，预后较差[2]，因此值得深入研究。动物肿瘤模型为胆囊癌的研究提供了重要平台。
　　1969年Rygaard等[5]首次将人结肠癌组织接种于裸鼠皮下，成功建立了裸鼠皮下移植瘤模型后，裸鼠便被广泛地应用于人类肿瘤的基础理论和临床治疗的实验性研究中。由于裸鼠移植瘤在组织病理形态学、生物学特性及对化疗药物的敏感性等方面与其原发的肿瘤相似，因此，裸鼠移植瘤模型是目前肿瘤学研究中较为理想的动物模型[6]。
　　目前常用的皮下移植瘤建模方法是细胞注射法和瘤组织块法[7]。本研究将两种方法结合，大大简化了移植瘤模型的制备过程，适合长期传代。
　　本研究首先将体外培养的GBC-SD细胞悬液注射到裸鼠皮下，制备皮下移植瘤模型。同许多学者研究[8-10]结果一致：注射法皮下移植瘤模型成瘤率高，细胞致瘤性强，注射较小的瘤细胞量即可致瘤，肿瘤生长平稳，生存期稳定。但细胞注射法成瘤时间相对较长，细胞体外培养时复苏、传代、冻存过程中都极易污染，培养周期长，比较昂贵，不适合长期传代[11]。 　　传统的组织块法瘤源多取自手术切除的存活胆囊癌组织，但实验成本较高，实验条件要求较高，取材难度较大。本研究细胞注射法成瘤后作为瘤源进行裸鼠异体移植和传代，避免了以上的不足，简化了移植瘤模型的制备。另外瘤块鼠间异体移植时成瘤稳定，成瘤率达100%。徐鸿绪[12]的研究用细胞注射法结合瘤组织块法成功建立了前列腺癌裸鼠移植瘤模型，裸鼠移植瘤成功率可达100%。洪国斌等[13]用此法成功制备了肝癌裸鼠移植瘤模型，肿瘤造模成功率为93.75%。汤静[14]用此法成功制备了肝癌裸鼠移植瘤模型，肿瘤造模成功率为100%。提高瘤组织块法成瘤率的方法有：瘤源的取材尽快完成；欲接种的肿瘤组织制备成适宜大小的瘤组织块；在裸鼠饲养及各种操作过程中严格遵循无菌原则等。
　　目前对于移植瘤建模方式的研究主要集中在探讨建模成瘤率及移植瘤与原肿瘤一致性的问题[15]。本研究两种方法成瘤率皆高，几乎可达100%，病理切片HE染色结果显示两种方法在组织学形态上并无差异，可以推论在相同的微环境下通过细胞悬液所建立的模型和通过组织块建立的模型组织学形态及生物学特性同样无差异。
　　总之，将细胞注射法与组织块法结合，移植瘤能在裸鼠体内持续增殖和长期传代，且移植瘤的形态与原人体肿瘤保持一致，是一种理想的建立人胆囊癌裸鼠移植瘤模型的实验方法，可为后续胆囊癌的研究提供良好的实验平台。
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　　（收稿日期：2015-12-02 本文编辑：卫 轲）
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