紫色胡萝卜中花青素的提取、分离及抗氧化活性研究

来源:用户上传      作者: 虎春艳　赵声兰　刘海鸥　林玉萍

　　【摘 要】 目的：从紫色胡萝卜中提取、分离花青素，并对提取所得的花青素进行体外抗氧化活性研究。方法：以维生素C作为阳性对照，研究不同浓度的花青素对・OH 、H2O2、O2-・的清除效果。结果：从紫色胡萝卜提取所得的花青素对・OH 、H2O2、O2-・均有较好的清除率。结论：紫色胡萝卜中分离提取的花青素有较好的抗氧化活性。
　　【关键词】 紫色胡萝卜；花青素；抗氧化；提取分离
　　【中图分类号】R2842 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）20-0033-03
　　紫色胡萝卜（Purple Carrot）为十字花科萝卜属植物，成熟于秋冬季节。紫色胡萝卜富含多酚，维生素和β-胡萝卜素等物质外，还含有丰富的花青素（Anthocyanins）。花青素又称花色素，是一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素， 属黄酮类化合物[1]，多以糖苷的形式存在，也称花色苷。从红葡萄渣中提取的葡萄皮红是最早且最丰富的花青素， 它于1879年在意大利上市[2]。花青素作为一种天然食用色素，安全、无毒、资源丰富，而且具有一定营养和药理作用，在食品、 化妆品和医药等方面有着巨大的应用潜力。
　　研究发现，紫色胡萝卜中所含的花青素主要为稳定性较高且生物活性较好的酰化花青素，其含量占总花青素的70%以上[3]。花青素能减少动脉粥样硬化[4-5]，具有抗肿瘤[7]，抗菌消炎[7]，以及清除自由基的抗氧化作用[4，6，8]。在机体的新陈代谢过程中会产生超氧自由基、羟自由基等基团都是很多生理和病理的积极参与者[9]。国内对紫色胡萝卜的研究较少，导致营养价值极高的紫色胡萝卜一直没有被大众所认识[10]。而欧美等国将紫色胡萝卜作为一种保健食品被大量种植，紫色胡萝卜汁也深受大众喜爱[3-7]。本研究系统研究了紫色胡萝卜中花青素的提取、分离及体外抗氧化活性，为紫色胡萝卜的深度开发研究奠定一定的基础。
　　1 仪器与材料
　　11 仪器 UV-2450型紫外可见分光光度计（岛津企业管理（中国）有限公司）；CP214型号电子天平（奥豪斯仪器（上海）有限公司）； TG16-WS高速台式离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；HHS11-4R型电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）。
　　12 材料 硫酸亚铁、邻二氮菲、过氧化氢30%、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、邻苯三酚、三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）、硫酸亚铁、无水乙醇、浓硫酸、浓盐酸等均为国产分析纯，为汕头市达濠精细化学品有限公司产品；紫色胡萝卜购买自云南滇东北地区。
　　2 方法
　　21 花青素的提取 取一定量的新鲜紫色胡萝卜，去芯、充分捣碎后称量放入烧瓶内，加入80%的乙醇（料液比为1∶2），调节pH为3～4，在50℃水浴下回流提取1h，趁热抽滤，滤渣再用80%的乙醇回流提取30min，趁热抽滤。合并提取液，并将其旋转蒸发至无醇味，真空冷冻干燥得粗品。
　　22 花青素的分离、纯化 采用AB-8型大孔树脂对粗提的花青素进行纯化。其纯化流程为：花青素粗体物→AB-8型大孔树脂吸附1 h→用蒸馏水洗脱糖类、色素等→10%的乙醇（pH=4）洗脱杂质→30%乙醇洗脱杂质（pH=3～4）→80%乙醇洗脱（pH=3～4）→旋蒸（40℃、30r/min）→花青素纯化液→真空冷冻干燥→样品低温（4℃以下较好）保存备用。
　　23 不同浓度的待测液对・OH的清除率 羟自由基清除率的测定方法参考文献[11-12]，10mL具塞试管中加不同浓度的待测液1mL，依次加入1mL 075mmol/L FeSO4，1mL 075mmol/L邻二氮菲，最后加入001% H2O21mL，37℃保温1h，4mL蒸馏水调零，在536nm下测定吸光度。空白管用1mL蒸馏水代替花青素，1mL蒸馏水代替001% H2O2，损伤管用1mL蒸馏水代替花青素，样品空白管用1mL蒸馏水代替001% H2O2。
　　OH清除率=（1-A2-A3A0-A1）×100/%
　　式中，A0为空白管的吸光值；A1为损伤管的吸光值；A2为样品空白管的吸光值；A3为样品对照管的吸光值。
　　24 不同浓度的待测液对H2O2的清除率 测定方法参考文献[12-13]，25mL具塞试管中加不同浓度的待测液1mL，加入40mmol/L H2O2 25mL，加入65mL蒸馏水，室温反应10min后在230nm下测定吸光度。空白管用1mL蒸馏水代替花青素，样品空白管用25mL蒸馏水代替H2O2 。
　　H2O2清除率=A0-（A1-A2）A0
　　式中， A0为不加花青素的吸光度；A1为样品对照组的吸光度即加花青素又加40mmol/L H2O2；A2为不加40mmol/L H2O2的吸光度。
　　25 不同浓度的待测液对O2-・的清除率 采用邻苯三酚自氧化法产生O2-・，加不同浓度待测液进行清除，测定方法参考文献[8-12]，并略做修改。10mL具塞试管中加入15mL 005mol/L Tris-HCl缓冲溶液（pH=82），15mL蒸馏水，摇匀，25℃水浴中保温20min，取出后立即加入25℃预热过的3mmol/L邻苯三酚05mL（以10mmol/L的HCl配制，空白管用10mmol/L的HCl代替邻苯三酚）迅速摇匀后倒入比色杯中，在325nm处测定吸光度，计算线性范围内每1min吸光度的增加值，即为邻苯三酚的自氧化速率ΔA对照。测定待测样品时加入邻苯三酚前先加入一定量（15mL）的待测物（不同浓度的花青素），同时减少同体积的蒸馏水，其余操作同上，测出ΔA样品。
　　按上式计算出超氧阴离子的清除率。
　　3 结果与讨论
　　31 花青素的提取、分离 提取液制备过程中需操作迅速，减少花青素的氧化，提高提取率。先处理好树脂备用，花青素提取液制备好后立即上样。质量浓度为3g/mL上样速率为2mL/min，洗脱速率为2mL/min，洗脱体积随上样体积增大而增大，可根据颜色变化进行下样，即颜色由暗紫色变为浅紫色，紫色部分即为有效的花青素。240 g新鲜的紫色胡萝卜用乙醇提取，经大孔树脂洗脱纯化后，再经旋蒸冷冻干燥可得花青素样品约03g。由此可知花青素的提取率为0125%。 　　由图1可知，紫色胡萝卜提取物最大吸收波长在526nm，而520～530nm为花色苷类物质的特征吸收峰，与文献报道花青素的紫外-可见吸收光谱一致[14]。
　　32 不同浓度的待测液对・OH的清除率 由图2知，随着花青素和Vc浓度的增大，其对・OH的清除率逐渐增大，并且在同浓度下，Vc对・OH的清除率要稍高于紫色胡萝卜中花青素对・OH的清除率。花青素浓度为15mg/mL时，其清除率达到了50%以上；花青素浓度为30mg/mL时，其对・OH的清除率为87%，由此可以知道从紫色胡萝卜中提取的花青素具有较强的抗氧化活性。Vc在06mg/mL时清除率就已经达到50%以上，30mg/mL时对・OH的清除率能达到94%。在较高浓度下，花青素和Vc对・OH的清除率比较接近。
　　33 不同浓度的待测液对H2O2的清除率 由图3可知，随着花青素和Vc的浓度不断增大，其对H2O2的清除率也不断增大，花青素的清除率呈现出良好的线性关系。在花青素浓度为15mg/mL时，花青素对H2O2的清除率就能到达50%，但Vc在其浓度为20mg/mL时，对H2O2的清除率才能达到50%以上； 当浓度低于20mg/mL时，花青素对H2O2的清除率高于Vc对H2O2的清除率；当浓度大于20mg/mL时，花青素对H2O2的清除率低于Vc对H2O2的清除率。
　　34 不同浓度的待测液对O2-・的清除率 由图4、5可知，花青素对O2-・的清除率随浓度的增大而增大，当花青素的浓度为为15mg/mL时达到50%以上，在浓度为20mg/mL时，其对O2-・的清除率达到90%。浓度越大，对O2-・的清除效果越好。当浓度为008mg/mL时，Vc对O2-・的清除率达到了9667%，在004mg/mL时达到50%以上。花青素浓度为141mg/mL对O2-・的清除率相当于004mg/mL的Vc对O2-・的清除率。从数据可看出，Vc对O2-・清除率高于紫色胡萝卜中的花青素对O2-・清除率。
　　4 结论
　　本实验研究了紫色胡萝卜中花青素的提取、分离，并对所得花青素进行抗氧化活性的研究。结果表明，紫色胡萝卜中提取所得的花青素有很好的抗氧化活性，但其抗氧化活性没有同浓度的维生素C的活性高，这可能是在花青素的提取分离过程中的部分环节，导致部分花青素聚集体解离、失去了活性。通过该研究，增加了花青素的来源，提高紫色胡萝卜的利用价值；使花青素在医药和保健等领域能够得到更好的应用；此外紫色胡萝卜物美价廉，含有丰富的糖类物质，本身具有很好的口感，可以作为很好的保健饮品在日常饮食和市场中推广。
　　参考文献
　　[1]Anna R， Renato C N， Daniela V， et al. Modification of glass transition temperature through carbohydrates addition and anthocyanin and soluble phenol stability of frozen blueberry juices[J]. J Food Eng， 2003，56（2-3） ：229 -231.
　　[2]Joao RM A， Eleonora DA， Anja P， et al. Characterization of major enzymes and genes involved in flavonoid and proanthocyanidin biosynthesis during fruit development in strawberry （Fragaria×ananassa）[J]. Arch Biochem Biophys， 2007， 465（1） ：61 -71.
　　[3]Anne C K， Beverly A C， Steven J B， et al. Plasma and Urine Responses Are Lower for Acylated vs Nonacylated Anthocyanins from Raw and Cooked Purple Carrots [J]. Agric. Food Chem，2005，53： 6537-6542.
　　[4]Ghiselli A， Nardini M， Baldi A， et al. Antioxidant activity of different phenolic fractions separated from an Italian red wine[J]. Agric. Food Chem，1998， 46： 361-367.
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