薄荷组织培养与污染控制

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　　 【摘 要】采用不同浓度和配比的植物激素6-BA和NAA与MS基本培养基组合。以薄荷的叶片、茎段、茎尖作为外植体进行组织培养。筛选出不定芽诱导最多的外植体取材，以及最适合进行薄荷组织培养的植物激素配比方式。结果表明：三种外植体中，茎尖的不定芽诱导数最多，出芽时间最短；其次为茎段，叶片效果最差。茎尖诱导最适培养基为MS + 6-BA 1.5mg/ L + NAA 0.08mg/L ；茎段最适培养基为MS + 6-BA 1.5mg/ L + NAA 0.02mg/ L。另外，铁离子浓度过高会抑制不定芽的生长。用饱和漂白精溶液+吐温-80处理外植体材料，可有效降低污染率。
　　 【关键词】薄荷；组织培养；污染控制
　　
　　
　　 薄荷（Mentha haplocalyx）为唇形科（Labiatae）薄荷属（Mentha），多年生宿根性草本植物。茎直立，四菱形，叶近于无柄，卵圆状，边缘具不规则细齿，有芳香气味，须根[1]。对环境适应性强，喜温暖、湿润环境。原产于南欧，我国河北、江苏、浙江等地都有养殖。薄荷全草入药，能疏散风热，清利头目。全株分布油腺，油中主要成分为薄荷酮、薄荷醇等，可用于制药、化妆品及食品制作行业。中国是薄荷油、薄荷脑的主要输出国之一。生产上多采用根茎和秧苗繁殖薄荷。但由于繁殖材料可能携带母体病毒和薄荷连年种植，依照这两种方法种植的薄荷品种逐代退化，产量和原油质量下降，进而影响市场竞争力。利用植物组织培养的方法，能够脱除病毒，且保证遗传上的稳定性[2-4]。
　　1.材料和方法
　　 实验材料
　　选用无虫害、健壮的薄荷（材料来自苗圃种植薄荷）。
　　 1.2实验方法
　　 1.2.1配制母液
　　 按下列顺序称取药品，依次溶解在蒸馏水中，配制10×大量元素母液1000ml、100×微量元素母液1000ml、200×铁盐100ml、100×维生素500ml。
　　 （1）10×大量元素母液1000ml：KNO3 19.00 g，NH4NO3 16.50g，MgSO4・7H2O 3.70g，CaCl2・2H2O 4.40g，KH2PO4 1.70g。
　　 （2）100×微量元素母液1000ml：MgSO4・4H2O 2230 mg,ZnSO4・7H2O 860mg,H3BO3 620mg,KI 83mg,Na2MoO4・2H2O 25mg, CuSO4・5H2O 2.5mg,CoCl2・6H2O 2.5mg。
　　 (3) 200×铁盐100ml: Na2・EDTA 745 mg,FeSO4・7H2O 557 mg。
　　 （4）100×维生素500ml：甘氨酸 100mg,VB1 5mg,VB6 25mg,烟酸 25mg。
　　 1.2.2实验所用生长调节剂
　　 薄荷的组织培养过程中需要用到NAA（萘乙酸）、6-BA（6-苄基氨基嘌呤）。配制NAA母液用95%乙醇或1N NaOH溶解，然后补蒸馏水；6-BA用1N HCl溶解，然后补蒸馏水。两种植物生长调节剂母液浓度均为0.25 mg/ml [5-6] 。
　　 1.2.3在基本培养基上添加不同浓度和配比的6-BA和NAA.
　　 (1)MS培养基：
　　 配制MS基本培养基1000ml：分别量取10×大量元素母液100ml，100×微量元素母液10ml，200×铁盐5ml，100×维生素10ml，于1000ml的烧杯中，再称取肌醇100mg，蔗糖30000mg，加双蒸水至1000ml。
　　 (2)加入生长调节剂，分别配制8个浓度梯度：
　　 ①MS + 6-BA 1.5mg/ L + NAA 0.08mg/ L
　　 ②MS + 6-BA 1.5mg/ L + NAA 0.02mg/ L
　　 ③MS + 6-BA 1.0mg/ L + NAA 0.08mg/ L
　　 ④MS + 6-BA 1.0mg/ L + NAA 0.02mg/ L
　　 ⑤MS + 6-BA 1.0mg/ L + NAA 0.15mg/ L
　　 ⑥MS + 6-BA 2.0mg/ L + NAA 0.15mg/ L
　　 ⑦MS + 6-BA 2.0mg/ L + NAA 0mg/ L
　　 ⑧MS + 6-BA 0mg/ L + NAA 0.1mg/ L
　　 每个梯度分别做三个重复，分装到三个三角瓶中。
　　 (3)使用1N HCl 和1N NaOH在电子PH仪上调节PH至6.0。
　　 (4)每瓶培养基中加入琼脂浓度为8%[7]。
　　 (5)微波炉煮沸培养基三次至琼脂完全溶解，用铝箔封口，121℃高温灭菌20min。
　　 1.2.4外植体的获取
　　分别剪取薄荷的叶片、茎段和茎尖。将材料上面的泥土洗净（见3）。在烧杯中先用70%乙醇浸泡30秒，然后用0.1%氯化汞消毒8分钟，取出用无菌蒸馏水冲洗三次。注意要将氯化汞完全冲净。吸干水后，用无菌剪子和镊子在超净工作台中将每种外植体处理成长0.5cm的小块。
　　 1.2.5每瓶培养基中接种外植体密度为6个。每种配比的培养基分别接叶片、茎段和茎尖三瓶。将所有培养基放置于温度为25±2℃，光照12 ~16 h/d ,光照度为2000 lx培养室中培养。观察同种激素配比培养基对不同外植体部位诱导结果的影响；以及激素不同配比培养基中同种外植体不定芽诱导情况[8]。
　　 1.2.6另配三个培养基。将6-BA和NAA的浓度设定为1.5:0.08这一水平(最适宜不定芽生长的激素配比)，将铁离子浓度设成三个水平梯度，分别为2Fe(1),Fe(2),0.5Fe(3).观察同一激素水平下。不同铁离子浓度对茎尖生长的影响[1]。
　　2. 结果和分析
　　 2.1记录不同配比6-BA和NAA培养基中薄荷的不定芽增殖情况。数据统计按照下列方式：不定芽诱导率（%）=（发芽外植体数/接种的外植体数）×100%。芽诱导数既受6-BA浓度的影响，又受NAA浓度的影响。在含有单一激素的培养基上，外植体萌发较晚，芽数少，长势不好，尤其是在IBA为0时，外植体培养半个月左右，大部分趋于死亡，最高死亡率可达90%左右。在6-BA浓度为0的培养基上，随时间的延长，部分外植体也相继死亡，死亡率在60%左右。
　　
　　 结果表明：①最适宜薄荷组织培养的外植体材料是幼嫩的茎尖；②6-BA和NAA对薄荷组培不定芽的诱导、增殖有一定促进作用；③通过筛选，最终确定最适合茎尖诱导不定芽的激素组合为MS + 6-BA 1.5mg/ L + NAA 0.08mg/ L，最适合茎段诱导不定芽的激素组合为MS + 6-BA 1.5mg/ L + NAA 0.02mg/ L。薄荷组织培养对激素的要求较低[9]。
　　 2.2不同铁离子浓度对薄荷茎段培养的影响
　　 观察实验结果表明，铁离子浓度过高，会抑制薄荷芽的生长，而较低浓度的铁离子却有利于诱导不定芽。
　　3.试验中污染的控制
　　由于薄荷叶片生有软毛，在进行组织培养时，对外植体灭菌处理很困难，生长过程中污染率太高。本次试验中，先用饱和漂白精溶液+吐温-80处理外植体材料10分钟，用流动水冲干净后再进行一般采用的0.1%氯化汞处理。结果发现，比不用该种方法处理的外植体污染率大大下降[10]。
　　 4.讨论
　　影响薄荷茎段组织培养的因素有很多，如培养基，培养材料的品种，所用生长调节剂的配比以及培养基的PH值，接种密度等都影响组织培养的结果。不同的培养材料各有其最适合的培养基。本实验采用最常用的MS培养基，所用激素为较常用的不定芽诱导组合：6-BA和NAA组合。但究竟哪种激素组合更适合薄荷不定芽的增殖以及其组培苗的生长还有待进一步探索。
　　参考文献
　　[1] 刘铭，田伟等.薄荷组织培养研究[J].现代中药研究与实践，2005（19）：8-11.
　　[2]徐德然，高山林.薄荷组织培养快速繁殖技术[J].中国药科大学学报，1992，23（2）：115-117.
　　[3]师素云，薛启汉等.薄荷离体培养愈伤组织诱导与植株分化[J].江苏农业科学，2000（6）：27-28.
　　[4]Rech EL.Pires M JP.Tissue culture propagation of Mentha spp by the use of axillary buds[J].Plant Cell Reports,1986.5:17-18.
　　[5] 赖家业，杨振德.野薄荷的茎段培养[J].广西热作科技，2000(3):9-11。
　　[6]李格.薄荷再生植株构建中的产业化关键技术研究[D].新疆石河子大学，2004.
　　[7]吴涛，朱玉玲等.薄荷组培苗的组培快繁技术研究[J].安徽农业科学，1999,（6）：609-612.
　　[8] 臧玉琦，吴涛等.薄荷茎尖生长点立体培养[J].中国农学通报，1998（1）：47-73.
　　[9] 颜昌敬.植物组织培养手册[M].上海科学技术出版社，1990,26-31,62-79.
　　[10]张艳玲，姚雷。芳香植物唇萼薄荷组织培养中的污染控制[J].上海农业学报，2005,21（1）：4-6.

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