转基因水稻多重PCR和Real―time PCR定性检测中的问题与策略

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　　摘要：随着转基因水稻研究在世界范围内的研究和开发，以及转基因水稻商业化的争议性加剧，相关部门对粮食安全、食品安全更加关注，农业科研单位检测转基因水稻也将具有重要意义。参照农业部的质检标准书和转基因PCR检测中的实践经验，对抗虫转基因水稻在转基因检测中可能出现的问题进行了技术层面和理论层面分析;同时对转基因抗虫水稻的启动子、终止子、内参基因、靶基因等几个元件的检测分别进行探讨，并重点分析了启动子和终止子的检测工作，根据研究者的工作经验报道，从植物病毒学原理和植物基因工程的理论角度，提出了对转基因PCR定性检测中可能遇到问题的解决方案。
　　关键词：转基因水稻;定性检测;启动子;终止子;Bt基因;多重PCR;Real-time PCR
　　中图分类号：Q78;S511        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2015）02-0262-04
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.002
　　Problems and Strategies Qualitatively Detecting Genetically-modified Rice with Multiplex PCR and Real-time PCR
　　QIU Juan
　　（Food Crops Research Institute，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China）
　　Abstract： As genetically-modified（GM） rice will be commercialized， qualitatively detecting GM rice becomes more and more important. Based authors’ practice in detecting of  transgenic Bt  rice with the quality standard of Chinese Ministry of Agriculture， the potential problems were analyzed from technical level and theoretical perspective. The detection of transgenic components （promoter， terminator， reference gene and target gene etc） of GM rice with PCR was discussed. The possible solutions were proposed from the principles of plant virology and genetic engineering based on previous reports.
　　Key words：genetically-modified（GM） rice;qualitative detection;promoter;terminator;Bt gene;multiplex PCR;real-time PCR
　　转基因技术应用于作物以来，转基因产品如玉米、大豆、棉花等都已有商业化的品种问世;目前在世界上使用最多的转基因商业化基因是抗除草剂基因和Bt杀虫基因。而水稻作为一种主粮，商业化步伐远远慢于这几种作物;目前最有可能商业化的转Bt杀虫基因的是中国与国际水稻所合作研制的“华恢1号”、“Bt汕优63”和欧洲研制的富含维生素A的Golden rice[1，2]。
　　自从国家给转基因水稻发放了安全证书，转基因水稻的商业化成为了热门的议题。目前农业部发放安全证书的转基因水稻有抗虫转基因水稻“华恢1号”和“Bt汕优63”，国家制定了关于作物和转基因水稻的检测方法标准[1，3]。国家质量检测部门有完善的种子和食品检测系统，来定性检测是否含有转基因成分。但是随着转基因水稻即将大规模的种植，科研人员在研究和育种过程也有大量的样品需要检测，主要目的有以下几个：①更好地进行常规品种转基因育种工作，防止转基因的品种污染常规品种，保持种质的纯合，同时检测转基因的水稻在田间有没有发生漂移;②节省人力物力，大量的水稻样品送到专门的质检部门检测价格昂贵;③有些检测样品中的转基因成分元件，是超出国家质量标准检测范围的。
　　转基因作物和转基因食品的检测方法有很多，例如PCR、Southern Blot、基因芯片等[4-7]。常规和便捷的方法是普通PCR以及由其衍生出的半定量PCR方法[8，9];在国内外使用的最多定性作用更强的是Real-time PCR[10-12]。多重PCR检测方法被广泛使用[4]。本文根据自己的一些实践，总结出了在食品检验、科研或者育种工作中进行多重PCR检测分析转基因样品中的几个要点。
　　1  污染源的杜绝
　　转基因检测中，只有杜绝一切污染源，才有可能在后续的检测中做出正确的判断。如果没有做好防止污染，很容易出现假阴性和假阳性。因此所有的试剂须新鲜现配、灭菌，枪头、离心管等要严格灭菌，玻璃器皿需要清洗干净[13]。样品必须防止交叉污染，条件允许的话，可以进口高质量的离心管、枪头等，以便在后续的试验中起到排除污染的作用[12]。
　　2  样品DNA的提取方法
　　DNA的提取方法既可以采用经典的CTAB方法，也可以按照农业部的质检标准书的方法，这两种方法用于PCR和半定量PCR、Real-time荧光定量PCR都有很好的结果[3，14];条件允许的话，也可以采用试剂盒。有学者采用快速提取法获得的转基因番茄DNA，用于Real-time PCR检测，取得了很好的结果;鉴于这一点，快速方法提取的转基因水稻DNA，也应该可以适用于Real-time PCR的检测，这就为检测大量的水稻DNA样品提供了便捷的途径[3，15-17]。Cankar等[18]、Demeke等[19]在水稻转基因检测的实践中，采取适用于RFLP分子标记检测的水稻DNA快速提取法，取得了比较好的效果。 　　3  转基因水稻的多重PCR检测
　　根据农业部的质检标准书，采用的是多重PCR和Real-time PCR的方法。在转基因的检测中，有4个检测元件：启动子、终止子、靶基因、内参基因。转基因的定性检测中，首先要检测的是内参基因，因为内参基因能确定DNA模板的质量;然后是检测启动子和终止子，在检测出启动子或者终止子以后，还要进一步检测靶基因。只有两个以上的转基因元件被检测出，才能定性为转基因的水稻[3，4，9，20]。
　　3.1  内参基因的检测
　　在定性检测转基因水稻中，会设置内参基因，农业部的质检标准书采用的是水稻sps（蔗糖磷酸合成酶）基因[3，21];也可以采用常规试验中经常用的水稻β-Actin基因的引物（在不同的物种中高度保守，组织和细胞中的表达相对恒定内参基因的检测），可以对模板进行定性为水稻的DNA，同时可以根据PCR产物条带的亮度来确定模板的质量。
　　3.2  启动子的检测
　　3.2.1  CaMV 35S启动子的检测  根据农业部制定的质检标准书，在目前的转基因水稻中的定性检测一般检查的是花椰菜病毒35S启动子。早期的水稻转基因多采用这个启动子，这次农业部批准的“Bt汕优63”也是采用的CaMV 35S启动子。
　　3.2.2  含CaMV 35S启动子的转基因水稻和病毒感染的定性区分  转基因食品中CaMV 35S启动子中有一个关键性问题就是区别转基因与病毒感染和污染[22-24]。在食品的安检和十字花科蔬菜的转基因定性检测中，通常会检测是否有CaMV 35S启动子转基因元件还是被花椰菜病毒感染了[22]。但是在确定没有污染的情况下，检测出35S启动子并不能定性样品含有转基因成分。花椰菜病毒会感染很多十字花科的蔬菜，病毒基因组也会整合到其侵染的植物基因组里面（感染水稻的可能性很小），在这种情况下，可以根据花椰菜病毒的外壳蛋白基因或复制酶基因设计特异性引物，也可以根据被花椰菜病毒感染后的特殊产物设计特异性引物，在转录水平上来定性是含CaMV 35S启动子成分的样品还是被花椰菜病毒感染了[25-31]。在一般情况下，水稻并不是花椰菜病毒的宿主，被感染的可能性不大，因此，这项检测只有在质量检测要求特别严格的情况下会被采用。同时，通过定量荧光Real-time PCR也可以排除样品是被花椰菜病毒感染或者污染还是转基因，具体的方法参见后文关于荧光PCR定量检测的内容[3，10]。
　　3.2.3  其他启动子  随着转基因技术的不断发展，更多被农业科学家采用的是组织特异性的启动子，例如新一代的转基因水稻就是采用组织特异性表达的启动子[32]。因此，随着转基因水稻品种越来越多，更多种类的启动子检测将会出现在质检标准中[33]。
　　3.3  终止子的检测
　　3.3.1  植物基因工程的原理  根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质粒，其特定部位能与植物的DNA发生整合，因此常被用作植物基因工程中的载体。
　　3.3.2  Nos终止子  在转基因植物中，常采用Nos终止子来构建载体，“华恢1号”和“Bt汕优63”也是采用的Nos终止子， 因此可以按照农业部的质检标准书用PCR定性检测Nos终止子[3，34]。Nos终止子是农杆菌菌株Ti质粒的T-DNA上的胭脂碱合成酶的终止子。胭脂碱属于冠瘿碱，在与植物共生或者转化植物以后，会释放出对植物有害的毒素，因此在Ti质粒上构建载体的过程中，会剪切掉这个基因，但是会保留这个基因的终止子（Nos），并通常用这个Nos终止子作为转基因的终止子[35]。
　　3.3.3  其他终止子  植物转基因的构建方法表明，转基因载体基本采用的是农杆菌T-DNA上的冠瘿碱的终止子。农杆菌的不同菌株含有不同Ti质粒，其包含的T-DNA上的冠瘿碱也不同。例如，农杆菌菌株LBA4404的毒性区来自章鱼碱型质粒，农杆菌菌株GV3101的毒性区来自胭脂碱型质粒，农杆菌菌株EA101、EA105的毒性区来自琥珀碱型质粒。冠瘿碱有4种类型：章鱼碱（Octopine）、胭脂碱（Nopaline）、农杆碱（Agropine）、琥珀碱（Succinamopine），其终止子分别为 Ocs、Nos、Ags、Sus。在基因工程上最常用的是上面提到的胭脂碱型质粒和它的Nos终止子，其次就是章鱼碱型质粒和它的Ocs终止子[36-38]。因此在转基因的定性检测中，可以根据每个实验室采用的质粒和构建方法的不同，设计别的终止子引物，例如Ocs终止子的引物[35]。
　　3.4  靶基因的检测
　　最近中国颁发安全证书的“Bt汕优63”和“华恢1号”都是转基因抗虫水稻，是高抗鳞翅目害虫转基因水稻品系;含有Bt融合型杀虫蛋白基因Cry1Ac/Cry1Ab[1]。对这两种转基因水稻的检测，需要根据Bt融合杀虫蛋白的基因来设计引物。
　　随着越来越多的转基因水稻将要获批准上市，农业科研单位在种质创新和科研中的需要，会有更多的农用基因在检测中出现[33]。
　　3.5  标记基因的检测
　　在转基因水稻中常会含有GUS基因、抗生素基因、除草剂等标记基因，因此也可以对这些转基因元件进行检测;但是随着转基因技术的发展，在现阶段转基因育种中，标记基因在后期的工作中通常用共转化等方法被剔除掉，这样剔除了标记基因的品种才更安全，才会用于商业化[39，40]。因此，标记基因的检测在早期的转基因筛选检测中会用到，但是在后期的育种鉴定一般不会采用。不过也可以用在转基因的后期工作中，鉴定品种是否进一步剔除了标记基因。
　　4  模板和引物 　　根据农业部的质检标准书，采用的是含有“Bt汕优63”或“华恢1号”的DNA作为阳性模板，并采用CaMV 35S启动子、Nos终止子、Bt融合蛋白基因和内参基因来检测样品;阳性模板应该为单拷贝插入，这样将便于在定量荧光PCR的分析。
　　由于样品的不确定性，在进行上述检测以外，还可以采用别的模板和引物来检测可能出现的其他种类的转基因元件。例如Ocs终止子、抗除草剂基因、花椰菜病毒的基因、韧皮部特异性表达启动子等。如果没有现成的水稻DNA模板，含有这些元件基因的质粒也可以被选作模板，在做PCR的过程中，要根据试剂盒中的说明，水稻模板DNA和质粒DNA要选择不同的终浓度[41，42]。引物要送到技术质量好的公司合成，模板要保证质量和选择的正确性，防止反应出现假阴性、假阳性。
　　5  转基因产品的定量Real-time PCR的定性分析作用
　　转基因中的定量实时荧光PCR是为普通PCR做补充的。由于转基因的普通PCR检测灵敏度达到0.1%[20]， 而且花椰菜病毒的35S启动子非常容易污染检测样品，在没有别的办法排除样品被污染或病毒感染的情况下，实时荧光PCR可以提供非常好的分析数据[3，10，12]。以被含CaMV 35S启动子的外源物污染和被病毒感染的样品为例，分析如下：第一，样品被含有CaMV 35S启动子的外源物污染。这种情况下荧光PCR会检测出35S启动子，但是其丰度会比单拷贝转基因DNA阳性模板的丰度要低;第二，样品被病毒感染。由于病毒一般不会感染植物的每个细胞，因此检测出来的启动子丰度也会比单拷贝转基因的DNA阳性模板要低。因此可以根据定量PCR来区分样品是转基因还是被污染或者被病毒感染了[9，10]。
　　6  小结
　　针对这次农业部发放安全证书的两个转基因水稻品种“Bt汕优63”和“华恢1号”的PCR定性检测，可以选取含有启动子CaMV 35S、终止子Nos、含有Bt融合蛋白基因的转基因水稻DNA作为阳性模板，选取非转基因水稻DNA作为阴性模板，对水稻DNA样品进行检测。但这种检测只能定性检测出样品是不是“Bt汕优63”或“华恢1号”，国内外的实验室在转基因生产育种中，还生产了很多其他的转基因水稻品种，采用的转基因元件跟这两个是不完全一样的，甚至完全不一样。对一个未知样品完全定性确定是否为转基因的水稻，还需要多设计出几对引物（其他终止子、启动子、靶基因）进行检测。由于越来越多的转基因品种并非采用的CaMV 35S的启动子，而且这个启动子在检测中很容易受到污染和病毒感染的干扰，因此检测终止子反而更为可靠。现有的报道结果表明，在构建植物基因工程载体中，基本上采用的是农杆菌的T-DNA上的冠瘿碱的终止子（Nos终止子、Ocs终止子），因此，可以根据这些终止子设计引物组，对未知样品进行检测。此外，本研究也可以在实践中摸索出快速提取水稻DNA的方法，提取的DNA质量可以适用于Real-time PCR和半定量常规PCR，可以为大量的转基因水稻样品检验提供便捷。
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