荔枝内生乳酸菌的筛选、鉴定及发酵效果分析

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　　摘要：【目的】筛选用于果汁发酵的荔枝内生乳酸菌，为解决发酵果汁专用乳酸菌少的问题提供新思路。【方法】以荔枝果肉为试验材料，通过MRS-溴甲酚紫平板法分离筛选荔枝内生乳酸菌，测定初筛菌株的发酵产酸和生长能力，筛选出发酵性能最优菌株，并进行形态学观察、生理生化试验和16S rDNA鉴定;以常用果蔬汁发酵菌种植物乳杆菌为对照菌株，进行荔枝内生菌发酵荔枝果汁的感官评价、微生物、理化指标和营养物质含量研究。【结果】从荔枝果肉中筛选出1株发酵性能优良的荔枝内生菌（编号LZ1），该菌菌落呈乳白色圆形凸起，边缘整齐，革兰氏阳性细菌，菌体细胞呈球形或卵圆形，单个、成对或链状排列;厌氧生长，能发酵纤维二糖、葡萄糖、果糖等8种碳水化合物;16S rDNA鉴定结果表明该菌与肠膜明串珠菌葡聚糖亚种（Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum）的同源性达99%以上，结合形态特征及生理生化试验结果，鉴定该菌株为肠膜明串珠菌葡聚糖亚种。该荔枝内生肠膜明串珠菌能在荔枝果汁中生长良好，发酵果汁无分层现象，有浓郁的荔枝清香味，感官评分显著高于对照菌植物乳杆菌（P<0.05，下同），活菌数达4.85×109 CFU/mL，高于植物乳杆菌，但差异不显著（P>0.05）;肠膜明串珠菌和植物乳杆菌发酵果汁的乳酸含量（9.63和13.83 g/kg）显著高于不接菌果汁（0.44 g/kg），pH（3.73和3.54）显著低于不接菌果汁（4.68）;荔枝内生肠膜明串珠菌发酵果汁中的维生素（Vc）含量高于植物乳杆菌和不接菌果汁，对果汁中果糖和葡萄糖的利用能力也强于植物乳杆菌，两株菌发酵果汁的葡萄糖含量分别较不接菌果汁下降31.4%和26.7%，果糖含量降幅分别为43.4%和21.7%;荔枝内生肠膜明串珠菌发酵果汁中游离氨基酸保留率为87.3%，略高于植物乳杆菌（84.4%），两株菌在发酵过程中各种氨基酸的种类和含量变化有所不同。【结论】筛选的荔枝内生肠膜明串珠菌在荔枝果汁中生长良好，发酵的荔枝果汁既保存和优化果汁的营养和口感，又增添益生菌的保健功能。
　　关键词： 荔枝;内生菌;筛选;鉴定;肠膜明串珠菌葡聚糖亚种;发酵果汁
　　中图分类号： S667.1                          文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）01-0137-07
　　0 引言
　　【研究意义】荔枝（Litchii chinensis Sonn.）为无患子科荔枝属常绿小乔木，原产于我国华南亚热带，有悠久的种植历史，且我国是世界最大的荔枝产出国。荔枝美味香甜，富含生物活性物质，具备多种保健功效，是岭南特色水果中的佳品。但其采收期在盛夏高温季节，加上其果皮与果肉在结构上完全分离的特殊构造，导致荔枝采收后极易褐变和腐烂变质，不耐贮藏;除了鲜食，目前市场上主要有荔枝干、荔枝罐头、果汁饮料、果酒等传统荔枝加工品，急需一批技术含量高、营养功能成分保护好、产品附加值高的果蔬深加工产品。以水果为发酵基质的乳酸菌发酵果汁是集水果营养价值和益生菌保健功能于一体的新型发酵饮料（宋苏华，2012）。国内外研究乳酸菌发酵果汁结果显示，经乳酸菌发酵后的果汁产品色、香、味均有明显改善，具有调节胃肠道消化、抑制病原菌、增强免疫力及抗衰老等功效，且能有效改善传统益生菌乳制品乳糖不耐症和高胆固醇（廖雪义等，2014;Siti et al.，2016）。菌株选择是乳酸菌果汁发酵的关键技术之一。目前，研究中用于水果发酵的专用乳酸菌菌株甚少，所用菌株对水果发酵适应性不强，造成现有乳酸菌发酵水果产品风味、活菌数、营养成分等方面不理想（谢明勇等，2014）。因此，筛选出具有优良发酵性能的水果发酵专用菌是乳酸菌果汁发酵技术研究的首要任务。【前人研究进展】目前，已有一些乳酸菌发酵荔枝果汁和果渣的研究，但发酵菌株以牛奶和蔬菜发酵菌株为主。郑欣（2014）向鲜榨并经巴氏灭菌的荔枝汁中接入6种常用乳酸菌進行发酵，筛选出较优的菌株;以干酪乳杆菌作发酵菌种，对经超高压处理荔枝汁进行发酵，得到的荔枝发酵果汁具有更好的色泽、风味和总体接受性，同时也含有更高的总酚含量和抗氧化能力;40 ℃贮藏4周后，发酵荔枝汁中干酪乳杆菌的活菌量高于1.02×108 CFU/mL;龚小洁（2015）优化乳酸菌在荔枝果渣中的发酵条件，并比较6种乳酸菌发酵荔枝果渣营养品质的变化差异，在发酵的基础上开发功能性荔枝果渣果粉产品。植物内生菌与其宿主间存在相互依存及互惠的关系，植物内生菌中分离出的次生代谢产物也存在生物活性成分（杜慧娟等，2008）。近年来，有学者研究发现内生益生菌用于发酵保鲜果蔬产品具有较好的效果。Di Cagno等（2010）从菠萝中分离出植物乳杆菌和红色乳杆菌用于发酵菠萝果汁，该发酵果汁在4 ℃下储藏30 d后仍保持高活菌数和抗氧化性，且比未发酵果汁的色泽和口感更佳;郭丽琼等（2015）从海带中分离出降解亚硝酸盐和胆固醇效率均高的植物乳杆菌菌株La10，以其发酵海带，可去除海带的腥味，降低褐藻胶含量，提高还原糖和总糖含量，降低在整个发酵过程中的亚硝酸含量，远低于自然发酵和国家标准中规定的亚硝酸盐含量;Liao等（2016）从芒果中分离并通过16S rDNA基因序列鉴定出内生肠膜明串珠菌，该菌株在芒果果汁中生长良好，发酵芒果汁在4 ℃下储藏30 d后，活菌数为6.46×109 CFU/mL，发酵芒果汁总糖含量低于未发酵果汁，DPPH自由基清除能力高于未发酵果汁，果汁的总酚在发酵果汁中也得到较好保存。【本研究切入点】目前，荔枝内生菌可用于荔枝保鲜（马锞等，2014）和卷烟产香（周丽娟等，2010）等，尚未见荔枝内生菌用于果汁发酵的研究报道。【拟解决的关键问题】从荔枝果肉中筛选适于荔枝发酵的内生乳酸菌用于发酵特性研究，以期为荔枝发酵果汁的研制提供优良菌株，并为水果内生菌应用于其全汁发酵饮料的研发提供新思路。 　　1 材料与方法
　　1. 1 试验材料
　　试验荔枝品种为桂味，由东莞市农业科学研究中心提供，采收时间为2017年7月，采收后运送至实验室于-10 ℃冷库保存备用。植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）购自台湾亚芯生物科技有限公司。MRS肉汤培养基、MRS琼脂培养基、氧化酶试纸、格里斯氏（Griess）、二苯胺、靛基质试剂和尿素生化管均购自广东环凯生物科技有限公司;双氧水（H2O2）、氯化钠、淀粉、硝酸钾、葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、蔗糖、海藻糖、水杨苷、麦芽糖、纤维二糖等均购自广州化学试剂厂;溴甲酚紫购自天津市天新精细化工开发中心;明胶购自广州健阳生物科技有限公司;乳酸、L-抗坏血酸和D-果糖购自德国Dr.Ehrenstorfer公司;D-葡萄糖购自中国食品药品检定研究院;氨基酸混合标液购自中国计量科学研究院。
　　主要仪器设备：榨汁机（Cucina，荷兰皇家飞利浦公司）、立式蒸汽灭菌锅（YXQ-LS-SⅡ，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、台式冷冻离心机（3K15，德国SIGMA公司）、生化培养箱（LRH-250，上海一恒科学仪器有限公司）、UV-1800全波长扫描分光光度计（日本岛津公司）、pH计（FiveEasy，瑞士梅特勒—托利多公司）、电热恒温水浴锅（HWS26型，上海一恒科学仪器有限公司）、液相色谱仪（1260，美国安捷伦科技有限公司）、超高压液相色谱仪[Ulti Mate 3000，赛默飞世尔科技（中国）有限公司]。
　　1. 2 试验方法
　　1. 2. 1 荔枝内生乳酸菌筛选
　　1. 2. 1. 1 荔枝内生乳酸菌初筛 将果实表面消毒后去皮，果肉用榨汁机打成浆，取15 mL果浆转入200 mL灭菌MRS肉汤培养基中，富集培养24 h后取其发酵液，以无菌生理盐水按10倍稀释法稀释，将各级稀释液分别涂布于加有溴甲酚紫的MRS琼脂培养基上，在36 ℃下培养24 h进行产酸菌分离。在出现单菌落的培养基上，根据菌落形态，挑取使溴甲酚紫产生变色的菌落进行镜检，并接入MRS肉汤培养基进行培养，进一步挑选出G（+）菌落，反复3次，分离纯化得到纯培养。将筛选出的各乳酸菌菌株分别编号。
　　1. 2. 1. 2 最优发酵菌株筛选 筛选出的各乳酸菌菌株分别接种于250 mL MRS肉汤培养基中，于36 ℃下培养24 h后测定各乳酸菌发酵特性，包括产酸能力（pH）和生长能力（24 h活菌数、OD值），筛选出发酵性能优良的荔枝内生乳酸菌菌株进行鉴定。
　　1. 2. 2 荔枝内生乳酸菌鉴定
　　1. 2. 2. 1 形态学观察 观察乳酸菌培养基表面生长菌落的形态、颜色等;挑取幼龄培养物，涂片、革兰氏染色，显微镜下观察菌体形态、大小、革兰氏染色反应，以及芽孢的有无、形态和着生位置等。
　　1. 2. 2. 2 生理生化试验 进行氧化酶、接触酶、葡萄糖产酸产气、碳水化合物发酵产酸、精氨酸产氨、淀粉水解、七叶灵水解、明胶液化等生理生化试验。
　　1. 2. 2. 3 16S rDNA鉴定 引物27F：5′-AGAGTT
　　TGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTG
　　TTACGACTT-3′。PCR反应体系25.00 μL：10×Taq Buffer 2.50 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2.00 μL，Ex Taq（5 U/μL）0.25 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.50 μL，ddH2O 16.25 μL，3.00 μL DNA模板。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，进行30个循环;72 ℃延伸10 min。PCR结束后电泳检测为阳性的PCR产物送至上海美吉生物医药科技有限公司测序。将测序结果提交GenBank进行BLAST比对，并选取同属内近缘种的16S rDNA基因序列進行同源性分析，利用MEGA-X构建系统发育进化树。
　　1. 2. 3 荔枝果汁内生乳酸菌发酵特性试验
　　1. 2. 3. 1 发酵用荔枝果汁制备 荔枝经清洗、去皮、去核并榨汁，果汁倒入已灭菌的三角瓶内，每瓶250 g，80 ℃杀菌10 min，迅速冷却至40 ℃左右备用。
　　1. 2. 3. 2 乳酸菌发酵菌液制备 将荔枝内生乳酸菌和对照菌植物乳杆菌的保藏培养物分别置于MRS肉汤培养基中进行活化复壮，之后在MRS肉汤培养基（36 ℃，静止发酵）中培养20 h。
　　1. 2. 3. 3 荔枝果汁乳酸菌发酵 制备3组（每组3瓶）发酵用荔枝果汁，向第1组接入2%活化好的荔枝内生乳酸菌菌液，第2组接入2%活化好的植物乳杆菌菌液，第3组不接菌（对照）;36 ℃下培养24 h后放入4 ℃冰箱中后熟24 h，再取样分析微生物数量、理化指标和营养物质含量。
　　1. 2. 3. 4 感官评定方法 随机抽取10名有食品感官评定经验的人员，采用评分检验法对荔枝乳酸菌发酵果汁的组织形态、风味、酸甜度、色泽和口感5项指标（各20.0分）进行评分。以所有鉴评人员的平均分数为综合指标，对发酵果汁的组织形态、风味、酸甜度、色泽和口感采用单纯描述性方法。感官评分标准见表1。
　　1. 2. 3. 5 荔枝发酵果汁指标测定 参照GB 4789—2010对发酵果汁进行乳酸菌菌落总数计数;用pH计直接测定pH;参照GB 5009.157—2016测定乳酸含量;参照GB 5009.86—2016测定维生素（Vc）含量;参照GB 5009.8—2016测定果糖和葡萄糖含量;利用柱前衍生气相色谱法测定游离氨基酸含量，具体样品处理和测定步骤参照杨月欣和王光亚（2002）的方法。
　　1. 3 统计分析 　　采用SPSS 17.0对试验数据进行统计分析。
　　2 结果与分析
　　2. 1 荔枝内生乳酸菌的筛选结果
　　通过MRS-溴甲酚紫平板法分离筛选荔枝内生菌（图1），选取生长活力较强的4株乳酸菌（编号LZ1、LZ2、LZ3和LZ4）进行发酵特性研究，结果见表2。确定LZ1为生长特性最优的荔枝内生乳酸菌菌株，该菌株发酵产酸和生长能力较强，在36 ℃下培养24 h后测定，pH为4.25，显著低于其他3株乳酸菌（P<0.05，下同），活菌数达16.00×109 CFU/mL，OD值为1.46，显著高于其他3株乳酸菌。将该菌株进行鉴定和荔枝果汁发酵试验。
　　2. 2 荔枝内生乳酸菌的鉴定结果
　　2. 2. 1 形态学观察结果 荔枝内生乳酸菌LZ1在MRS琼脂培养基上培养48 h后进行菌落形态及细胞形态观察，结果（图2）显示，菌落呈圆形，乳白色，凸起，边缘整齐;革兰氏染色反应显微镜观察，LZ1为革兰氏阳性细菌，菌体细胞呈球形或卵圆形，单个、成对或链状排列。
　　2. 2. 2 生理生化试验结果 荔枝内生乳酸菌LZ1生理生化试验结果（表3）表明，LZ1厌氧生长，接触酶阴性，无还原硝酸盐能力，不产生吲哚，不水解精氨酸，能发酵纤维二糖、葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、蔗糖、海藻糖、水杨苷和麦芽糖等碳水化合物。根据凌代文和东秀珠（1999）的方法推测，LZ1菌株近似肠膜明串珠菌葡聚糖亚种（Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum），但需进行16S rDNA鉴定进一步确认。
　　2. 2. 3 16S rDNA鉴定 BLAST比对分析发现，LZ1与肠膜明串珠菌葡聚糖亚种的同源性达99%以上。为明确菌株之间的亲缘关系及系统地位，利用MEGA-X构建系统发育进化树（图3），同时结合LZ1的形态特征及生理生化试验结果，鉴定菌株LZ1为肠膜明串珠菌葡聚糖亚种。
　　2. 3 荔枝果汁内生乳酸菌发酵特性试验结果
　　2. 3. 1 荔枝内生乳酸菌发酵果汁感官评价结果 荔枝内生肠膜明串珠菌和对照菌植物乳杆菌发酵的荔枝果汁组织形态良好，无分层现象;有浓郁的荔枝清香味，无酒精发酵味。荔枝内生肠膜明串珠菌发酵果汁酸甜适中，色泽乳白色，接近荔枝果肉成熟后的天然色泽;植物乳杆菌发酵果汁则偏酸，在后熟过程中植物乳杆菌果汁发酵液的表面有淡褐色漂浮物出现，整体色泽不如肠膜明串珠菌果汁发酵液。不接菌的荔枝果汁香味减弱，有少许酒精发酵味，果汁色泽淡黄色，有轻微褐变。鉴评员对3种果汁的感官评分结果见表4，3种果汁感官评价分数差异显著，以荔枝内生肠膜明串珠菌发酵果汁的感官评分最高，感官品质明显优于其他两种果汁。
　　2. 3. 2 荔枝内生乳酸菌发酵果汁微生物数量和理化指标测定结果 由表5可知，荔枝内生肠膜明串珠菌能在荔枝果汁中生长良好，活菌数达4.85×109 CFU/mL，高于植物乳杆菌，但二者差异不显著（P>0.05，下同）;乳酸是肠膜明串珠菌和植物乳杆菌产生的主要有机酸，发酵果汁的乳酸从含量对照的0.44 g/kg显著升高到肠膜明串珠菌的9.63 g/kg和植物乳杆菌的13.83 g/kg，随着乳酸浓度的升高，pH从对照的4.68显著下降到肠膜明串珠菌的3.73和植物乳杆菌的3.54。
　　2. 3. 3 荔枝内生乳酸菌发酵果汁中主要营养物质含量测定结果
　　2. 3. 3. 1 Vc、果糖和葡萄糖含量测定结果 由表6可知，肠膜明串珠菌和植物乳杆菌的荔枝发酵果汁中Vc含量显著高于不接菌的对照果汁，但两株菌发酵果汁的Vc含量间无显著差异，以肠膜明串珠菌发酵果汁的Vc含量最高。肠膜明串珠菌对果汁中果糖和葡萄糖的利用能力强于植物乳杆菌，两株菌发酵果汁中果糖含量相比对照果汁的降幅分别为43.4%和21.7%，差异显著;葡萄糖含量的降幅分别为31.4%和26.7%，差异不显著。
　　2. 3. 3. 2 游离氨基酸含量测定结果 由图4可知，两种乳酸菌发酵果汁中游离氨基酸的总含量均少于不接菌果汁，肠膜明串珠菌荔枝发酵果汁的氨基酸保留率为87.3%，略高于植物乳杆菌的84.4%，从对照果汁中共检测出10种氨基酸组分，肠膜明串珠菌荔枝发酵果汁中检出8種，植物乳杆菌荔枝发酵果汁中检出9种。两株乳酸菌在发酵中均能消耗脯氨酸和丝氨酸，此外，肠膜明串珠菌发酵过程消耗果汁中全部的蛋氨酸、赖氨酸和31.4%缬氨酸，植物乳杆菌发酵过程消耗果汁中全部的丝氨酸和36.8%天门冬氨酸。
　　3 讨论
　　内生乳酸菌的发酵性能可以很好地保持果蔬中的主要营养物质及果蔬汁液流变特性，也能最大限度地延长果蔬汁保质期。Di Cagno等（2011）的研究结果表明，甜樱桃果酱虽然表现为低pH和高酚物质含量，不利于乳酸菌的生长，但甜樱桃的自源乳酸菌种戊糖乳杆菌SWE5和植物乳杆菌FP3能在果酱中良好生长，并通过自身的代谢来适应周围环境。本研究筛选出的荔枝内生肠膜明串珠菌不仅能在荔枝果汁中生长良好，活菌数高达4.85×109 CFU/mL，产生适量乳酸，口感适宜，还可提高Vc含量，降低还原糖含量，保留80%以上的游离氨基酸。荔枝内生菌发酵荔枝果汁的能力强于常用果蔬汁发酵菌植物乳杆菌，为果汁功能型发酵饮料的专用菌种筛选提供了新思路。
　　荔枝含糖高，不适合患有肥胖症和糖尿病的人群食用。乳酸菌发酵果汁能显著降低水果中糖含量，有利于开发低糖型健康食品。Mousavi等（2011）利用植物乳杆菌发酵石榴汁，发现发酵后其葡萄糖和果糖质量分数分别下降19%和13%;郑欣（2014）比较了6种不同乳酸菌发酵荔枝汁的特性，发现乳酸菌发酵后能显著降低荔枝汁中还原糖含量，其中明串珠菌降糖能力最强;赖婷等（2016）比较分析了7种不同乳酸菌发酵龙眼果浆的降糖能力，结果发现明串珠菌利用还原糖能力强于植物乳杆菌。本研究筛选的荔枝内生肠膜明串珠菌对水果中常见的还原糖（果糖和葡萄糖）表现出良好的降解能力，可使荔枝果汁中的葡萄糖和果糖含量分别下降31.4%和43.4%，效果优于植物乳杆菌（下降26.7%和21.7%），与郑欣（2014）、赖婷等（2016）的研究结果一致。本研究结果为开发低糖健康型的荔枝乳酸菌发酵功能性饮料提供参考。 　　乳酸菌发酵主要通过同型发酵和异型发酵两种代谢途径。同型乳酸发酵利用葡萄糖，参与糖酵解途径，主要产物为乳酸;异型乳酸发酵利用戊糖通过戊糖磷酸途径，其主要产物除乳酸外，还有乙醇、乙酸和CO2等多种风味代谢产物（Abdel-Rahman et al.，2011）。本研究中，肠膜明串珠菌和植物乳杆菌发酵果汁的乳酸含量高于对照果汁，pH低于对照果汁;发酵果汁中荔枝内生肠膜明串珠菌的活菌数高于植物乳杆菌，但前者的乳酸含量低于后者，pH高于后者，可能是因为两种菌种属于不同的发酵类型，肠膜明串珠菌发酵荔枝果汁为异型乳酸发酵，产生较少乳酸，植物乳杆菌发酵荔枝果汁为同型乳酸发酵，乳酸转化率高。因此，利用两种或多种不同发酵型的乳酸菌进行混菌发酵果蔬汁，对果蔬汁风味和营养品质的影响值得进一步探索。
　　4 结论
　　筛选出的荔枝内生肠膜明串珠菌在荔枝果汁中生长良好，发酵荔枝果汁的能力强于常用果蔬汁发酵菌植物乳杆菌，既保存和优化荔枝果汁的营养和口感，又增添益生菌的保健功能。
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