市售瓶装矿泉水微生物的检测与分析

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　　摘要：自然界的水中含有细菌、淡水藻类、原生动物、病毒等多种类型的微生物，其中有一些微生物可直接或间接导致人类患病。虽然市售瓶装矿泉水在装瓶前一般会对水源进行过滤灭菌处理，但是并不排除部分厂家因考虑成本的因素而未进行严格操作，因而目前市场上的瓶装矿泉水仍存在安全隐患。通过综述市售瓶装矿泉水中可能存在的微生物及其检测方法和防治措施，为相关部门进一步加强监督管理、提高市售瓶装矿泉水的质量提供理论参考标准。
　　关键词：瓶装；矿泉水；微生物；检测；防治
　　中图分类号：R155 文献标志码：A doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2019.05.055
　　Abstract：The water in nature contains bacteria，freshwater algae，protozoa，viruses and many other types of microorganisms. Some of these microorganisms directly or indirectly cause human diseases. Although the bottled mineral water on the market generally filters and sterilizes source of water before bottling，it does not exclude the fact that some manufacturers do not conduct rigorous operations due to cost fact. Therefore，bottled mineral water on the market still has potential safety issues. The possible microorganisms in bottled mineral water on the market，with its detection methods，prevention and control measures were summarized. It provided a theoretical reference for the relevant departments to further strengthen supervision and management and improved the quality of bottled mineral water.
　　Key words：bottled；mineral water；microorganisms；detection；prevention and treatment
　　水是生命之源，人類的生产活动离不开水，水质安全是人类健康的第一要素。随着生活水平的不断提高，人们对饮用水的安全问题日益重视，而瓶装矿泉水饮用方便、易于携带，因此已成为人们日常生活中不可或缺的饮品。若瓶装矿泉水中微生物含量超标，轻则导致人体患肠道疾病，并引起呕吐、腹泻等症状，重则可致人死亡，尤其对已患病的老年人和婴幼儿危害最大[1]。我国饮用水的相关标准主要有《瓶（桶）装饮用纯净水卫生标准》（GB 17324—2003）、《生活饮用水卫生标准》（GB 5749—2006）、《饮用天然矿泉水》（GB 8537—2008）和《食品安全国家标准包装饮用水》（GB 19298—2014）。其中，《饮用天然矿泉水》2008版本要求铜绿假单胞菌不得检出[2]，《食品安全国家标准包装饮用水》（GB 19298—2014）不再保留菌落总数、霉菌和酵母计数、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌指标，仅保留大肠菌群指标，增加了条件致病菌——铜绿假单胞菌指标，二者均不可检出[3]。
　　1 细菌菌落总数的测定
　　水样中菌落总数是指1 mL水样在营养琼脂培养基上于有氧条件下培养48 h后所含细菌菌落的总数。通过菌落总数可判断生产的卫生环境和瓶装饮用水的质量，预测饮用水的贮存期限。菌落总数多少虽然不能说明致病菌的多少，但菌落总数超标会增大致病菌超标的概率，在一定程度上也就增加了患病的几率[4]。
　　细菌菌落总数的检测方法有平皿计数法、涂布平板法和酶底物法。但由于细菌种类繁多，每种菌的生长条件和速率都存在差异，所以计算出的细菌菌落总数只是一个近似值。
　　1.1 平皿计数法
　　平皿计数法所用的培养基为营养琼脂培养基，将1 mL的水样与冷却至45 ℃以下的未凝固的营养琼脂混匀于培养皿中，待凝固后翻转培养皿，放进36℃的恒温培养箱中培养48 h后取出计数[5]。营养琼脂的浇灌量需一致，菌落总数不在30～300 CFU/mL范围的样品要重新制作（增加水样或稀释水样）。
　　1.2 涂布平板法
　　涂布平板法所用的培养基可以为营养琼脂培养基，也可以为牛肉膏蛋白胨培养基。将配制好且灭菌后的培养基趁热倒入无菌平板中，待凝固后再吸取0.1 mL水样滴于培养皿上，用涂布棒涂均匀，平放在桌上静置20～30 min，使菌液完全渗入，然后将平板倒转，于37 ℃下恒温培养48 h计数。涂布棒在涂水样时可能会将水样里的细菌带出，为使试验数据更加准确，徐维昌等人[6]为每份水样都准备了3份空白培养基，把水样滴于1号培养基涂布后，用涂布棒于2号培养基上再涂1次，最后在3号培养基上涂1次，3份培养基上长出的菌落总数之和即为此份水样中所含的细菌总数。
　　1.3 酶底物法
　　近年来出现了一种测定菌落总数的新方法，即酶底物法。刘玉红等人[7]通过这种方法清晰、准确、快速地读出了细菌菌落的总数。此法是将1 mL水样和9 mL IDEXX复合酶底物技术TM酶混匀于爱德士Simplate圆盘中，放置于37 ℃恒温培养箱中培养48 h。培养完成后，将样品圆盘在黑暗处于波长365 nm处的紫外灯下照射，细菌的菌落可产生荧光，最终根据MPN表（菌群最大近数）计出菌落的总数。 　　鲁巍等人[8]认为，由于饮用水中的贫营养环境不同于传统培养基，所以大多数在显微镜下观察到的细菌不能在传统培养基中生长，因此造成所得结果比实际结果低。国外常用AODC法和Baclight染色直接计数法对总细菌进行计数，用DVC法和HPC法对活细菌进行计数。
　　2 大肠菌群数的测定
　　大肠菌群是指在一定的培养条件下（36±1 ℃，24～48 h），能够发酵乳糖、产酸产气的需氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。在人畜粪便污染的水中可被大量检出，在富营养化的自然水体中也可检出，因此是评价瓶装饮用纯净水卫生标准的重要微生物指标之一。大肠菌群的检测方法有多管发酵法、滤膜法和酶底物法。
　　2.1 多管发酵法
　　多管发酵法是根据大肠菌群的发酵乳糖产酸产气的特征来检测水样中大肠菌群的方法。多管发酵法包括乳糖蛋白胨发酵法和乳糖胆盐发酵法[9]。乳糖蛋白胨发酵法所用的培养基有乳糖蛋白胨液体培养基和伊红美蓝平板培养基。取1 mL水样接种于乳糖蛋白胨发酵管中，放置一杜氏小管，于36.5 ℃条件下培养24～48 h。变黄且产气的再接种于伊红美蓝平板培养基上于36.5 ℃条件下培养24 h，对可疑菌落进行革兰氏染色镜检，挑取符合特征的菌落用乳糖蛋白胨液体培养基进行确证试验。根据阳性管数查表得出MPN数值，结果以MPN/100 mL作报告。
　　乳糖胆盐发酵法所用的培养基有乳糖胆盐液体培养基和亮绿乳糖胆盐液体培养基。取1 mL水样接种于乳糖胆盐发酵管中，放置一杜氏小管，于36.5 ℃条件下培养24～48 h。取样接种于亮绿乳糖胆盐培养液中于36.5 ℃下培养24 h，同样放一杜氏小管，如有产气确定为阳性，根据阳性管数查表得出MPN数值，结果以MPN/100 mL报告。
　　2.2 滤膜法
　　滤膜法分为国标滤膜法和酶底物滤膜法[10]。滤膜法是0.45 μm的滤膜经过抽滤一定量的水样（100～ 250 mL），而使得细菌被截留在滤膜上，随后通过培养、计数和鉴定被截留菌的方法。
　　2.2.1 国标滤膜法
　　国标滤膜法的培养基为品红亚硫酸钠培养基和乳糖蛋白胨液体培养基。将有细菌的一面贴在品红亚硫酸钠培养基上，于37 ℃条件下培养24 h，挑取颜色为紫红色的菌落进行革兰氏染色，凡为革兰氏阴性的菌群都需接种于乳糖蛋白胨液体培养基进行复发酵试验，再于37 ℃条件下培养24 h，放置一杜氏小管，若培养液变黄且产气则判定为大肠菌群阳性，结果以CFU/100 mL表示。
　　2.2.2 酶底物滤膜法
　　酶底物滤膜法的培养基为酶底物技术的选择性培养基。将有细菌的一面贴在酶底物培养基上，于37 ℃条件下培养24 h，有蓝绿色的菌群即证明有大肠菌群，结果以CFU/100 mL表示。
　　2.3 酶底物法
　　酶底物法的试剂是ONPG和MUG 2种营养指示剂[11]。大肠菌群细菌产生的β -半乳糖苷酶和大肠埃希氏菌产生的β -葡萄糖醛酸酶能分别分解2种指示剂，而使得营养液呈黄色，并且在波长366 nm的紫外灯下产生荧光。可用51孔定量盘作为试验的主容器，计数结果以MPN/100 mL表示。
　　3 铜绿假单胞菌的测定
　　铜绿假单胞菌原称为绿脓杆菌，是一种革兰氏阴性杆菌，是重要的水源和食源性致病菌。土壤、水、空气、皮肤表面、呼吸道和肠道中都有该菌存在。它是一种条件致病菌，免疫力低下的老人和婴幼儿易被感染，被烧伤烫伤的患者、有眼部疾病、血液病恶性肿瘤的患者，以及术后患者被感染后常使病情恶化，严重时可引起败血症。
　　铜绿假单胞菌的检测方法是滤膜法。有多种培养基可作为选择性培养基，其中最为常见的分离计数培养基为CN琼脂培养基[12]。此法除了CN琼脂培养基之外，还需要乙酰胺肉汤培养基、金氏B培养基、氧化酶试剂和钠式试剂。将过滤后有菌的一面贴在CN琼脂培养基上，于36±1 ℃条件下培养48 h，48 h后于波长360±20 nm处的紫外灯下观察。蓝/绿色、无荧光的菌落则直接判定为检出；黄色有荧光的菌落做乙酰胺肉汤（产氨）试验确认，加入钠式试剂，若溶液颜色从黄色变为砖红色，则判定为阳性、检出；红褐色无荧光的菌落，先做产氨试验，若结果为阳性则继续进行氧化酶试验。将新鲜的氧化酶滴于滤纸上，再将培养物涂布在上面，10 s内显深蓝紫色的为阳性；将氧化酶反应为阳性的培养物接于金氏B培养基上，于36±1 ℃条件下培养24 h以上，每天都取出在紫外灯下观察，5 d内能产生荧光的菌落判断为阳性。
　　邓军[13]在用上述方法检测铜绿假单胞菌时还做了对照试验，即将通过相同体积、相同水样的滤膜贴在乙酰胺琼脂培养基上，若出现扁平菌落且菌落周围培养基变为桃红色则判定为检出。CFC选择性培养基也可作为分离计数的培养基，SN/T 2099—2008[14]中详细介绍了配置方法，使用时应配合氧化酶、乙酰胺、葡萄糖酸盐等使用，其中还需要革兰氏染色。十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基也是铜绿假单胞菌选择培养基中的一种。孟凡亚等人[15]比较了铜绿假单胞菌在十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基A和B上的菌落生长率。伊鋆等人[16]比较了上述几种培养基的优缺点，他们认为近些年发展起来的显色培养基在各个方面均占优势，因此最适合定性、定量分离分析。
　　4 霉菌和酵母菌的测定
　　霉菌和酵母菌都属于真菌，二者外观的主要区别为霉菌有菌丝体，而酵母菌无菌丝体且大多为杆状或圆形。它们繁殖能力强，若摄入过多会引起人体的菌群失衡，从而对人体造成危害。
　　梁美丹等人[17]比较了正置培养和倒置培养的检出率，最终得出正置培养的检出率高于倒置培养。试验不但比较了2种培养方式，还采用了孟加拉红和马铃薯-葡萄糖-瓊指2种不同的培养基。将水样与培养基混匀后于28±1 ℃条件下培养5 d，在培养过程中应每天都进行观察，防止霉菌过量生长而导致菌丝交错影响观察，必要时可以稀释水样或增加水样的量，或用镜检法区分这2种菌。 　　张建明等人[18]认为用显色纸片检测霉菌和酵母菌具有比较好的效果，尤其是酵母菌。显色纸片是再显色培养基的基础上，通过改进制造而成，操作简单、方便携带，也不需要前期的准备工作，更兼有价格低廉、环保经济的特点。
　　5 病毒和原生动物的测定
　　病毒和微生物都是较为常见的病原微生物，其中，肠道病毒在自然水域中最为常见；肠炎病毒多见于被人畜粪便污染后的水源，对怀孕的妇女影响较大；轮状病毒会使免疫力不高的婴幼儿出现死亡的症状。常见的原生动物是贾第虫和隐孢子虫，前者会使人腹泻，严重时可致人死亡；后者是其他致病微生物的中间宿主，它的虫卵进入人体会带来潜在威胁。
　　张敏等人[19]提到检测病毒的方法比较多，但首先应用微孔过滤器对其进行收集，再开展洗脱、超滤、吸絮凝等过滤步骤。常规检测方法为直接电镜观察，免疫技术是一种较为精准的方法，还可以运用分子生物學的方法，但运用这种方法时要将培养物反转吸收起来，清除影响检测结果的干扰物。冯萃敏等人[20]提到国外采用PCR技术来检测水样中的肠道病毒和甲肝病毒，其耗时与传统的细胞培养相较缩短了50%。
　　检测原生动物一般也用显微镜直接观察，但容易漏检，因此张敏等人[19]认为免疫荧光分子学检测法也是认可度比较高的方法，刘志刚等人[21]研究建立了肝吸虫虫卵DNA的提取和PCR检测方法，可快速检测到虫卵，具有特异性。
　　6 检测细菌的新型方法及应用
　　ATP生物发光法[22]可以作为一种快速检测饮用水样中细菌总数的方法。这是一种以生物发光反应为基础的快速检测技术，它的优点在于不需要培养过程，大大缩短了从取样到检出的时间。
　　环介导等温扩增技术[23-24]是一种新型的恒温核酸扩增技术，具有特异性强、灵敏度高、操作方便等特点，适用于大肠菌群和铜绿假单胞菌的检测。
　　化学发光免疫分析技术[25]是一种利用抗原与抗体的特异性结合来选择性识别和测定待测物的免疫分析方法，适用于对沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等多种细菌的检测，一般分为竞争法和双抗夹心法。
　　PCR技术是指在体外快速扩增基因和DNA序列的技术，可以快速准确地检测大部分细菌，但其仍然存在一些不足之处，所以经常与其他技术，如毛细管电泳技术协同使用[26]。而PCR技术也可以和核酸探针技术联合使用[27]，以使其达到一个更高的精准程度。
　　7 杀灭微生物 防治微生物感染的方法与注意事项
　　7.1 造成微生物超标的主要原因
　　水源受到污染[28]；生产车间设备条件差，没有严格严肃的态度；灭菌操作人员不注意个人卫生，携带微生物；回收的瓶、盖消毒不彻底；运输中因密封不严而导致空气中微生物进入等。
　　7.2 解决方法
　　对水源进行彻底消毒；相关部门加大惩罚力度和执行力，做好教育宣传；相关操作人员应具备专业水平，企业应当提供让他们不断学习的机会；瓶、盖彻底消毒，定期检查机器；有些微生物生长和瓶子的材料有关，应避免使用微生物喜欢聚集生长的材料；紫外线对一般细菌杀灭效果较好，对霉菌却无效，这时就可以采用液体超高温瞬间灭菌技术杀灭霉菌。
　　7.3 其他注意事项
　　在检验微生物时，应当注意：①检验人员操作规范；②实验室应当保持适宜的温度和湿度，防止微生物生长过快或过慢；③保证实验室的无菌机器没有损坏，可存在无菌环境。
　　近年来，瓶装水微生物指标不达标报道频发，我国水质环境面临着一个严峻的形势，相关部门应当加强监督管理、严格执法；同时矿泉水企业也应当遵守相关规定，做良心商家；消费者更应该擦亮眼睛，谨慎购买，瓶装水一旦开盖，尽快饮用，切勿长时间存放，否则将有饮用含有超标微生物饮用水的危险。
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