重楼茎叶总黄酮的提取纯化工艺及抗氧化活性研究

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　　摘要 [目的]优选重楼茎叶总黄酮的提取工艺，并测定其体外抗氧化活性。[方法]通過正交试验确定最优提取工艺并制备重楼茎叶总黄酮，对其DPPH清除率、羟基自由基清除率、超氧阴离子清除率进行评价。[结果]最优提取条件为60%乙醇提取，提取时间3.5 h，料液比为1∶20（g∶mL），制得粗提液中总黄酮含量为0.44%；按此方案进行放大提取，然后对粗提液浓缩进行D101大孔树脂富集纯化，富集得到的总黄酮含量提高到16.69%，总得率为5.28%；富集所得总黄酮DPPH清除率IC50为0.120 mg/mL，羟基自由基清除率IC50为0.190 mg/mL，超氧阴离子清除率IC50为0.120 mg/mL。[结论]正交试验优选的提取方法稳定可靠，通过大孔树脂富集得到的总黄酮具有一定的抗氧化活性。
　　关键词 重楼茎叶；总黄酮；提取工艺；优化；正交试验；抗氧化活性
　　中图分类号 R284.2 文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2019）09-0164-04
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.047
　　Abstract [Objective] The research aimed to optimize the extraction process of total flavonoids （TF） from stem and leaves of Paris polyphylla，and to study the antioxidant activities of the TF in vitro. [Method] The content of TF was chosen as the experimental index， orthogonal design was used to optimize the extraction condition of TF， and then 1，1diphenyl2picrylhydrazyl （DPPH） clearance rate， hydroxyl radical （·OH） scavenging rate and superoxide anion （O2·-） clearance rate were evaluated. [Result]The optimum extraction conditions： ethanol concentration was 60%， extraction time was 3.5 h and materialsolvent ratio 1∶20 （g∶mL）. The content of TF was 0.44%， which increased to 16.69% and the yield was 5.28% after D101 resin purification. IC50 of DPPH， ·OH and O2·- scavenging rate were 0.120 mg/mL， 0.190 mg/mL and 0.120 mg/mL， respectively. [Conclusion] The optimum extraction process is stable， reliable and TF of aerial part of Paris polyphylla have antioxidant activities.
　　Key words Stem and leaves of Paris polyphylla；Total flavonoids；Extraction process；Optimization；Orthogonal experiment；Antioxidant activities
　　重楼（Paris polyphylla Smith var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.）是百合科植物云南重楼的干燥根茎。重楼作为云南白药、抗病毒颗粒等中成药的主要原料来源，市场需求逐年增加，而其根的生长一般需要5～15年，造成资源短缺，对地上部位的茎叶研究和利用都较少，通常茎叶都直接废弃掉，造成了很大的浪费[1-3]。重楼茎叶中富含甾体皂苷[4]、黄酮[5]、多糖[6]等化学成分，药理研究证实，重楼茎叶提取物具有一定的抗肝癌、抗白血病、杀菌、止血、抗氧化等生物活性[7]。黄酮类化合物具有广泛的生物活性[8-10]，最为主要的活性是抗氧化活性[11]，主要表现在对自由基的清除和减少自由基的生成[12]。为了减少自由基的危害，寻找廉价、高效的自由基清除剂越来越受到关注[13]。笔者首先利用正交试验对重楼茎叶总黄酮的提取工艺进行优选，然后用大孔树脂对重楼茎叶的总黄酮进行富集，最后对其体外的抗氧化活性进行测定，以期从废弃的茎叶中获得具有较好抗氧化活性的黄酮类物质，为其应用提供理论依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 仪器
　　旋转蒸发仪（瑞士BUCHI，R-100）；分析天平（上海海康电子仪器，EA-2004）；磁力加热搅拌器（上海司乐仪器，85-2型号）；紫外-可见分光光度仪（美国Agilent，Cary-60）；布氏漏斗。
　　1.2 试材
　　重楼药材茎叶，产地为云南昆明，经昆明植物研究所刘海洋研究员鉴定为百合科植物滇重楼的地上部位；D101大孔树脂（沧州宝恩吸附材料公司）；芦丁（纯度98.7%，批号Q2700050，上海安谱科学仪器有限公司）；DPPH、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝及氢氧化钠均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；羟基自由基清除率试剂盒、超氧阴离子清除率试剂盒采购于南京建成科技有限公司。
　　1.3 方法
　　1.3.1 　　总黄酮含量测定及标准曲线绘制。参照文献[14]，用硝酸铝比色法对芦丁在500 nm下进行测定，得芦丁溶液在各浓度时的吸光度，以芦丁溶液浓度（y）对吸光度（x）绘制标准曲线。
　　1.3.2 重楼茎叶总黄酮提取的单因素试验。
　　1.3.2.1
　　提取料液比对总黄酮提取量的影响。取重楼茎叶粗粉5 g，按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40（g∶mL）分别加入60%乙醇，加热回流提取2次，每次2.5 h，静置至室温后用0.22 μm滤膜过滤，各取1 mL，用硝酸铝比色法在500 nm下测定吸光度，代入回归方程计算其总黄酮的含量，所得含量乘以提取液体积，即得总黄酮的提取量。
　　1.3.2.2 乙醇浓度对总黄酮提取量的影响。取重楼茎叶粗粉5 g，加入浓度为40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液50 mL，加热回流提取2次，每次2.5 h，静置至室温后用0.22 μm滤膜过滤，各取1 mL，按“1.3.2.1”方法计算总黄酮的提取量。
　　1.3.2.3
　　提取时间对总黄酮提取量的影响。 取重楼茎叶粗粉5 g，加入60%的乙醇溶液50 mL，加热回流提取2次，提取时间分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 h，提取完毕静置至室温后用0.22 μm滤膜过滤，各取1 mL，按“1.3.2.1”方法计算总黄酮的提取量。
　　1.3.3 重楼茎叶总黄酮提取的正交试验。
　　1.3.3.1 正交试验设计。影响重楼茎叶总黄酮提取效果的因素很多，根据单因素试验结果，选取3因素3水平进行正交试验。各因素的水平设计如表1所示。
　　取重楼茎叶粗粉，按照表1所述正交试验方案进行试验。各提取液静置后用0.22 μm滤膜过滤，分别取1 mL，按“1.3.2.1”方法计算总黄酮的提取量，将其作为评价指标对各试验进行对比。
　　1.3.3.2 验证试验。 称取3份重楼茎叶粗粉各5 g，用60%乙醇100 mL回流提取2次，每次3.5 h。将各提取液静置至室温后，用0.22 μm滤膜过滤，各取1 mL滤液，按“1.3.2.1”方法计算总黄酮的提取量。
　　1.3.4
　　重楼茎叶总黄酮对DPPH的清除作用。精密稱取1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）10.5 mg，用无水乙醇溶解后定容至100 mL备用；精密称取重楼茎叶总黄酮28.1 mg，用40%乙醇溶液将其定容至50 mL，得0.56 mg/mL的总黄酮溶液，将其用40%乙醇稀释成不同浓度（0～0.56 mg/mL）的溶液，分别取各浓度的重楼茎叶总黄酮溶液2 mL加入试管中，加入DPPH溶液2 mL，混匀后，室温下反应30 min，在517 nm下测定吸光度；空白组为4 mL的40%乙醇溶液，吸光度记为A0；样品组吸光度记为A1，对照组吸光度记为A2，DPPH清除率=1-（A1-A0）/（A2-A0）；用维生素C作为对照，同法进行测定。
　　1.3.5
　　重楼茎叶总黄酮对羟基自由基的清除作用。精密称取重楼茎叶总黄酮100.5 mg，用40%乙醇溶液定容至25 mL，得4.02 mg/mL的溶液，然后将其用40%乙醇溶液稀释成不同浓度（0～4.02 mg/mL）的溶液；精密称取维生素C 20.6 mg，用双蒸水定容至20 mL，得1.03 mg/mL的维生素C溶液，将其用双蒸水稀释成不同浓度（0～1.03 mg/mL）的溶液作为对照。将所配制的各样品和对照品严格按照试剂盒操作说明，对它们的羟基自由基清除作用进行测定，羟基自由基清除率=（1-A1/A0）×100%，其中，A1为加入样品后的反应液吸光度，A0为未加样品的反应液吸光度。
　　1.3.6
　　重楼茎叶总黄酮对超氧阴离子的清除作用。精密称取重楼茎叶总黄酮107.5 mg，用40%乙醇溶液定容至25 mL，得4.3 mg/mL的溶液，然后将其用40%乙醇溶液稀释成不同浓度（0～4.3 mg/mL）的溶液；精密称取维生素C 10.2 mg，用双蒸水定容至20 mL，得0.51 mg/mL的维生素C溶液，将其用双蒸水稀释成不同浓度（0～0.51 mg/mL）的溶液作为对照。将所配制的各样品和对照品严格按照试剂盒操作说明，对它们的超氧阴离子清除作用进行测定，超氧阴离子清除率=（1-A1/A0）×100%，其中，A1为加入样品后的反应液吸光度，A0为未加样品的反应液吸光度。
　　2 结果与分析
　　2.1 总黄酮含量测定及标准曲线绘制
　　以芦丁溶液浓度（y）对吸光度（x）做标准曲线，得到线性回归方程y=0.321 1x-0.001 4（R2=0.999 4）。
　　2.2 重楼茎叶总黄酮提取的单因素试验
　　2.2.1
　　提取料液比对总黄酮提取量的影响。由图1可知，随着提取溶剂的增加，总黄酮提取量逐渐增长，当提取料液比为1∶20时，总黄酮提取量最大，再增加提取溶剂时，总黄酮提取量趋于平稳，不再增加。
　　2.2.2
　　乙醇浓度对总黄酮提取量的影响。由图2可知，用60%～70%乙醇进行提取时，总黄酮提取量较大，过高浓度或过低浓度的乙醇提取时，提取量均会降低，这与黄酮类化合物在不同浓度乙醇中的溶解度有关，60%～70%的乙醇更利于黄酮类化合物的溶解。
　　2.2.3 提取时间对总黄酮提取量的影响。由图3可知，在1.0～2.5 h随着时间的增加，总黄酮提取量也逐渐增加，时间再延长时总黄酮提取量反而有下降的趋势，推测可能是长时间的加热会导致部分总黄酮降解所致。
　　2.3 重楼茎叶总黄酮提取的正交试验
　　2.3.1 正交试验结果分析。由表2可知，各因素对总黄酮提取量的影响从大到小依次为B、C、A，即乙醇浓度对总黄酮提取量影响最大，提取料液比和提取时间的影响较小，其中乙醇浓度对总黄酮提取量有显著的影响；根据各试验的结果，确定最佳工艺为A2B2C3，即在提取料液比为1∶20时，用60%乙醇提取3.5 h可以得到最大的总黄酮提取量，此时5 g重楼茎叶粗粉中可以得到含有22.05 mg总黄酮的提取物。 　　2.3.2 正交试验结果验证。经过验证，3组试验提取的总黄酮含量分别为22.50、23.10、22.71 mg，RSD为1.34%，结果表明该提取条件稳定可靠。
　　2.3.3 重楼茎叶总黄酮的富集。取重楼茎叶总黄酮100 g，按“2.3.1”优选的提取方案进行提取，提取液减压除去乙醇后，用D101大孔树脂进行总黄酮富集，得到总黄酮5.28 g，得率为5.28%；对其总黄酮含量按照“1.3.2.1”方法进行计算，其总黄酮含量为16.69%。
　　2.4 重楼茎叶总黄酮对DPPH的清除作用
　　从图4可以看出，重楼茎叶总黄酮与维生素C一样，对DPPH自由基的清除作用呈现出较好的量效关系，随着浓度的增加，清除作用逐渐增强。维生素C对DPPH自由基清除的IC50为0.009 mg/mL，最大清除率为96.94%；重楼茎叶总黄酮对DPPH自由基清除的IC50为0.120 mg/mL，最大清除率为86.84%。
　　2.5 重楼茎叶总黄酮对羟基自由基的清除作用
　　羟基自由基是活性氧自由基（ROS）中的一类，能够诱导DNA的损伤，对其研究越来越广泛[15]。从图5可以看出，重楼茎叶总黄酮与维生素C一样，对DPPH自由基的清除作用呈现出较好的量效关系，随着浓度的增加，清除作用逐渐增强。维生素C对羟基自由基清除的IC50为0.062 mg/mL，最大清除率为99.60%；重楼茎叶总黄酮对羟基自由基清除的IC50为0.190 mg/mL，最大清除率为98.90%。
　　2.6 重楼茎叶总黄酮对超氧阴离子的清除作用
　　在生物体新陈代谢过程中会产生各种活性氧，产生最早的就是超氧阴离子，它是导致自由基连锁反应的初始物质，是体内其他活性氧的主要来源[16]。从图6可以看出，维生素C对超氧阴离子的清除作用呈良好的线性关系，随着浓度的增加，其清除作用很快增大，在0.063 mg/mL时，清除作用即达到最大；与维生素C相比，重楼茎叶总黄酮对超氧阴离子的清除作用较弱，然而其清除作用也随着浓度的增加而增大，并且在4.300 mg/mL时能达到88.20%的清除作用，经过计算，重楼茎叶总黄酮在0.120 mg/mL时就能清除50%的超氧阴离子。
　　3 结论与讨论
　　该研究通过对单因素试验进行考察，研究不同提取时间、提取料液比、乙醇浓度对总黄酮提取量的影响，为正交试验各因素水平的选择提供参考，保证正交试验的科学性。通过正交试验得到最优提取工艺，即在提取料液比为1∶20时，用60%乙醇提取3.5 h，可制得粗提液中总黄酮含量为0.44%。D101大孔树脂被广泛用来富集黄酮类化合物，该研究通过D101大孔树脂对优选提取工艺所得到的提取物进一步富集，得到含量为16.69%、得率为5.28%的重楼茎叶总黄酮提取物，该提取物中包含的单体黄酮类型有待进一步的研究。
　　重楼的药用部位为其干燥根茎，地上部位的茎叶通常被废弃掉，该研究通过对重楼茎叶的回收利用，并挖掘其药理活性，增大该植物的药用范围，用DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率和超氧阴离子清除率对该部位的体外抗氧化活性进行评价，结果显示重楼茎叶总黄酮具有一定的抗氧化活性，这为重楼茎叶的应用开发提供了理论依据。
　　参考文献
　　[1] 李晨，刘立敏，杨敏，等.多叶重楼与云南重楼中4种重楼皂苷的积累差异[J].中成药，2017，39（7）：1454-1459.
　　[2] 张烨，赵倩，高科江，等.HPLC测定不同生长年限滇重楼中薯蓣皂苷元含量[J].安徽农业科学，2011，39（6）：3280-3281，3285.
　　[3] 杨金霞，张慧，叶方，等.武当山区不同采收期宽叶重楼地上部分总黄酮的累积规律[J].中国医药导报，2016，13（24）：16-20.
　　[4] 李晨，刘立敏，杨敏，等.多叶重楼与云南重楼中4种重楼皂苷的积累差异[J].中成药，2017，39（7）：1454-1459.
　　[5] 杨金霞，朱敏，叶方，等.武当山区不同品种重楼地上部分总黄酮含量比较研究[J].中国药业，2016，25（15）：16-18.
　　[6] 刘功成，王作伟，李亭亭，等.重楼叶多糖改善D-半乳糖衰老模型小鼠脾脏免疫功能和抗氧化能力[J].食品工业科技，2015，36（16）：366-369，383.
　　[7] 陈美红，梁梦园，闻晓东，等.重楼地上部分化学成分和药理作用研究进展[J].中国野生植物资源，2018，37（1）：44-50.
　　[8] 陶笑，徐媛，江解增.植物抗氧化性的主要活性成分研究[J].安徽农业科学，2017，45（25）：8-10，58.
　　[9] 薛梅，周卫平.龙牙百合鳞茎总黄酮提取工艺及抗氧化性研究[J].安徽农业科学，2017，45（3）：10-12，30.
　　[10] YANG X M，JIANG Y M，YANG J L，et al.Prenylated flavonoids，promising nutraceuticals with impressive biological activities [J].Trends in food science & technology，2015，44（1）：93-104.
　　[11] TAPAS A R，SAKARKAR D M，KAKDE R B.Flavonoids as nutraceuticals：A review [J].Herba Polonica，2010，7（3）：1089-1099.
　　[12] SARANGARAJAN R，MEERA S，RUKKΜMANI R，et al.Antioxidants：Friend or foe？ [J].Asian pacific journal of tropical medicine，2017，10（12）：1111-1116.
　　[13] XU D P，LI Y，MENG X，et al.Natural antioxidants in foods and medicinal plants：Extraction，assessment and resources [J].International journal of molecular sciences，2017，18（1）：1-32.
　　[14] 朱丹，楊菁，李林龙，等.龙胆中黄酮化合物含量测定的方法学研究[J].安徽农业科学，2017，45（14）：113-114.
　　[15] 王策，李侠，邓少颖，等.羟基自由基氧化对牛血清白蛋白结构及水合特性的影响[J].中国农业科学，2017，50（15）：3013-3023.
　　[16] 张雯，张娇，李平，等.荧光/化学发光探针成像检测超氧阴离子自由基的研究进展[J].分析化学，2017，45（12）：1838-1844.
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