牦牛胎盘免疫调节因子对小鼠免疫器官指数及组织结构的影响

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　　摘要 [目的]研究牦牛胎盘免疫调节因子对小鼠免疫器官指数和组织结构的影响。[方法]采用冷冻-超滤法制备牦牛胎盘免疫调节因子，用其对免疫抑制小鼠进行腹腔注射，10 d后称重并处死小鼠，剖检取脾脏和胸腺并称重，计算胸腺指数和脾脏指数，同时进行组织切片观察并进行脾脏淋巴细胞计数。[结果]药物组小鼠脾脏指数和胸腺指数显著高于对照组和模型组（P<0.05）；药物组小鼠脾脏淋巴细胞数目显著高于对照组和模型组（P<0.05）；免疫抑制小鼠脾脏和胸腺组织结构均发生明显变化。[结论] 牦牛胎盘免疫调节因子可以减轻环磷酰胺所导致的免疫器官损伤。
　　关键词 牦牛胎盘免疫调节因子；免疫器官；组织结构；淋巴细胞数目
　　中图分类号 R96 文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2019）09-0090-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.026
　　Abstract [Objective] To study the effects of placental immunoregulatory factor of yak on the immune organ index and tissue structure in mice. [Method] The placental immunoregulatory factor of yak was prepared by freezeultrafiltration method， and it was used to make intraperitoneal injection of immunosuppressed mice. After 10 days， mice was weighed and killed， spleen and thymus were collected through anatomy and weighed， and thymus index and spleen index were calculated. Tissue section observation was made and spleen lymphocyte was counted. [Result]The spleen index and thymus index of mice in drug administration group were significantly higher than those of control group and model group （P<0.05）. The number of spleen lymphocytes in drug administration group was significantly higher than that in control group and model group （P<0.05）. The tissue structure of spleen and thymus in immunosuppressed mice obviously changed. [Conclusion] The placental immunoregulatory factor of yak could alleviate immune organ damage caused by cyclophosphamide.
　　Key words Placental immunoregulatory factor；Immune organ；Tissue structure；Lymphocytes number
　　胎盤作为传统中药，在我国已有400～500年的用药史。胎盘免疫调节因子是从人胎盘中分离提取的小分子多肽，分子量在10 ku以下。研究发现[1-3]，胎盘免疫调节因子具有增强机体免疫力和抗疲劳、抗氧化和延缓衰老的作用。但由于人的胎盘短缺以及伦理学问题，目前开始使用动物胎盘替代人胎盘。牦牛主要生长于青藏高原海拔3 000 m以上地区，具有耐高寒、耐劳、抗病能力强等生物学特征。笔者通过注射环磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型[4]，研究牦牛胎盘免疫调节因子对小鼠脾脏指数、胸腺指数、组织学结构以及脾脏淋巴细胞数目的影响。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 胎盘及实验动物。青海省大通种牛场待产牦牛，经检验布鲁氏杆菌病和结核病均为阴性，自然分娩后采集其胎盘。选用60只雌、雄各半的小鼠（兰州大学实验动物中心）作为实验动物，体重18～20 g，常规饲养3 d后观察无异常，备用。
　　1.1.2 主要试剂与药品。生理盐水、环磷酰胺、酒精、苏木素、二甲苯等。
　　1.1.3 主要仪器。冷冻离心机、组织匀浆机、组织捣碎机、滤膜、Millipore YM-10型滤器、电子天平、染色缸、显微镜。
　　1.2 方法
　　1.2.1 胎盘免疫调节因子的提取。将已采集冷冻贮存的牦牛胎盘自然解冻，冲洗其表面血液及脏物，将其剪碎，-20 ℃反复冻融3次，用组织捣碎匀浆机12 000 r/min匀浆（3 min/次）共10次，然后用冷冻离心机8 000 r/min离心20 min后取上清液，再用0.45 μm的滤器进行微滤，将微滤出的滤液放入超滤器中，冷冻离心机7 000 r/min离心20 min，取上清液装入灭菌的青霉素小瓶中，备用。
　　1.2.2 实验动物分组及给药。60只小鼠分为药物组、对照组和模型组，每组20只，分笼喂养。对照组小鼠每天腹腔注射生理盐水0.2 mL， 药物组每天腹腔注射牦牛胎盘免疫调节因子0.2 mL，模型组每天腹腔注射0.2 mL生理盐水，并在第2、4、6天腹腔注射环磷酰胺20 mg/kg。饲养10 d后称重并处死小鼠。 　　1.2.3 免疫器官指数的测定。剖解小鼠，取脾脏和胸腺并称重，按照以下公式计算脾脏指数和胸腺指数：
　　脾脏指数=脾脏重量/体重（1）
　　胸腺指数=胸腺重量/体重（2）
　　1.2.4 脾脏和胸腺组织结构切片观察。
　　将切好的小块脾脏、胸腺组织放入中性甲醛溶液中固定，使用流水冲洗，梯度酒精进行脱水、复水，应用二甲苯透明后用石蜡进行包埋，切片、附片、染色，使用显微镜进行组织结构切片观察。
　　1.2.5 脾脏组织内淋巴细胞计数。
　　组织切片于显微镜40倍物镜下选取以淋巴小结中心点为中央的面积15 000 μm2的正方形，对此范围内的淋巴细胞进行计数，并换算成1 μm2内的淋巴细胞个数。
　　2 结果与分析
　　2.1 牦牛胎盘免疫调节因子对小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响
　　由表1可知，药物组脾脏指数和胸腺指数与对照组和模型组相比差异显著（P<0.05）。
　　2.2 牦牛胎盘免疫调节因子对小鼠免疫器官组织结构的影响 由图1、2可以看出，注射牦牛胎盘免疫调节因子的药物组小鼠与对照组相比脾脏淋巴小结更加明显，脾脏组织结构正常，成熟淋巴细胞增多；胸腺皮髓界限更加清楚，网状细胞增生不明显，成熟的淋巴细胞增多。
　　与对照组相比，模型组脾脏淋巴小结几乎消失，成熟的淋巴细胞减少，组织结构分界不清；模型组小鼠胸腺皮质萎缩和髓质增多，成熟的淋巴细胞减少和网状细胞增多比较明显。
　　2.3 脾脏组织内淋巴细胞计数结果
　　从图3可以看出，药物组单位面积内小鼠淋巴小结中淋巴细胞数目显著高于对照组和模型组（P<0.05）。
　　3 讨论
　　免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成的免疫系统[5]是动物机体的疾病防御系统。胸腺和脾脏是中枢免疫器官和外周免疫器官，分别为T淋巴细胞分化成熟和各种成熟淋巴细胞的定居及免疫反应发生的主要场所，因此胸腺和脾脏的发育状况直接影响机体的免疫功能，一定程度上反映机体的免疫水平[6-7]。
　　现代研究表明，胎盘中含有多种刺激机体免疫力的小分子活性物质，从而能够增强动物机体的免疫力[8-10]。该研究中模型组小鼠脾脏指数、胸腺指数与对照组和药物组相比差异显著（P<0.05）；小鼠脾脏组织切片淋巴细胞计数结果表明，药物组小鼠脾脏淋巴小结中淋巴细胞数目显著高于对照组和模型组（P<0.05），说明牦牛胎盘免疫调节因子可以明显提高小鼠的脾脏指数和胸腺指数以及脾脏中淋巴细胞数目，而脾脏指数增高与淋巴细胞数量增加是否有关还有待进一步研究。组织切片观察发现，与药物组和对照组相比，免疫抑制小鼠脾脏和胸腺组织结构发生了明显变化，说明牦牛胎盘免疫调节因子可以减轻环磷酰胺所导致的免疫器官损伤。
　　参考文献
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