番茄褪绿病毒侵染黄瓜的首次报道

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　　摘要 番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus（ToCV）是严重危害世界经济作物的一种病毒，寄主范围广泛。田间调查发现黄瓜Cucumis sativus表现出叶片黄化、脉间褪绿的疑似番茄褪绿病毒感病症状，同时叶片背面聚集了大量烟粉虱。采用RT-PCR方法对样品叶片和烟粉虱进行检测，ToCV感染率为65%，且发病叶片上烟粉虱携带ToCV。为进一步确定黄瓜是否为番茄褪绿病毒的新寄主，室内利用农杆菌侵染性克隆接种健康黄瓜，结果显示：接种30 d的黄瓜新生叶片出现褪绿症状。采用ToCV HSP70基因的引物对田间黄瓜叶片、烟粉虱和室内黄瓜新生叶片进行RT-PCR，扩增出约450 bp的条带，在NCBI上BLAST显示与KC887999.1的同源性最高，为99%。这些数据表明黄瓜是番茄褪绿病毒的寄主。这是ToCV感染黄瓜的首次报道。
　　关键词 番茄褪绿病毒; 黄瓜; 烟粉虱; RT-PCR
　　中图分类号： S 436.421  文献标识码： A  DOI： 10.16688/j.zwbh.2019100
　　Abstract Tomato chlorosis virus （ToCV） causes severe damage to crops worldwide， and it infects a wide range of plant hosts. In a field investigation， we found leaf etiolation， interveinal chlorosis of suspected symptoms of tomato chlorosis virus disease in cucumber （Cucumis sativus）; meanwhile a large number of Bemisia tabaci gathered on the back of cucumber leaves. The leaves and B.tabaci were tested by RT-PCR. The results showed that the ToCV infection rate was 65%， and B.tabaci on the infected leaves carried ToCV. In order to further determine whether cucumber is the new host of tomato chlorosis virus， healthy cucumbers were inoculated with agrobacterium-infected clones indoors. The results showed that chlorosis appeared in new leaves of cucumbers 30 days after inoculation. The primers of ToCV HSP70 gene were used to perform RT-PCR on cucumber leaves， whiteflies and new leaves of indoor cucumber， and a band of 450 bp was amplified. BLAST on NCBI showed the highest homology （99%） with KC887999.1. These data indicate that cucumber is the host of tomato chlorosis virus. This is the first report of ToCV infection in cucumbers.
　　Key words Tomato chlorosis virus; Cucumis sativus; Bemisia tabaci; RT-PCR
　　 番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus（ToCV）属于长线形病毒科Closteroviridae，毛形病毒属Crinivirus，于1998年在美国佛罗里达州的温室番茄中首次报道[1]。自2004年首次在中国台湾发现以来，已在北京、山东、天津、海南、湖南和云南等多个地区发现并迅速蔓延，对番茄等蔬菜生产造成严重损失[2-7]。该病毒只能通过韧皮部侵染的方式，由媒介昆虫以半持久方式传播，其中以烟粉虱Bemisia tabaci的传播能力最为高效。感染ToCV的植物一般是从中下部叶片出现症状并逐渐向上发展，中部叶片表现为叶脉间轻微褪绿黄化，底部叶片则出现明显的叶片褪绿黄化，叶脉深绿，感病叶片变脆且易折，叶片黄化疑似營养缺素症[8]。ToCV可侵染茄科、十字花科、夹竹桃科、藜科和菊科等多科植物[9-11]。
　　黄瓜Cucumis sativus是我国重要的保护地栽培蔬菜之一。中国各地普遍栽培，且许多地区均有温室或塑料大棚栽培，广泛种植于温带和热带地区。感染黄瓜的病毒主要有西瓜花叶病毒（WMV）、番木瓜环斑病毒（PRSV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、烟草花叶病毒（TMV）、黄瓜绿斑花叶病毒（CGMMV）和瓜类褪绿黄化病毒（CCYV）[12-14]。目前尚未有关于番茄褪绿病毒侵染黄瓜的报道。
　　2017年9月在湖南省蔬菜研究所基地发现黄瓜表现疑似ToCV感染症状，同时在叶背面发现大量烟粉虱。采集症状明显的黄瓜叶片及烟粉虱并通过ToCV特异性引物进行鉴定，随后利用农杆菌侵染性克隆接种健康黄瓜进一步验证黄瓜能否感病，以期明确黄瓜的受害情况，为预防和控制流行病毒病提供预警。
　　1 材料与方法
　　1.1 样品采集
　　2017年9月，在湖南长沙蔬菜研究所基地发现大量黄瓜叶片褪绿黄化、叶脉仍然保持绿色。随机采集叶片60份，其中显症样品50份、无症状样品10份，保存于-80℃冰箱备用。同时，收集带有烟粉虱的显症黄瓜叶片，烟粉虱放入离心管，叶片放入保鲜袋后带回实验室，并在显微镜下观察烟粉虱形态特征并区分雌雄。随后从采集的烟粉虱中随机选取12头，进行多头烟粉虱的RNA提取，重复3次，以明确烟粉虱样本是否携带ToCV[15]。并随机各选取雌雄性烟粉虱20头，分别鉴定烟粉虱的带毒率。采用以ToCV HSP70基因设计的特异性引物ToCV-3（表1）进行检测。 　　1.2 样品RNA提取、cDNA的合成及RT-PCR扩増
　　1.2.1 植物和烟粉虱总RNA的提取
　　田间黄瓜RNA的提取采用北京华越洋生物公司多酚多糖植物RNA提取试剂盒，步骤依照试剂盒说明书操作。烟粉虱RNA的提取采用TRIzol法并稍作修改。
　　1.2.2 反转录合成cDNA
　　体系步骤参照Vazyme生物公司HiScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper）产品说明书进行。以提取的总RNA为模板，Random hexamers为引物合成cDNA，-20℃保存备用。
　　1.2.3 PCR扩增和电泳检测
　　采用ToCV HSP70基因特异性引物ToCV-3F/ToCV-3R（表1）进行PCR扩增。PCR扩增体系为：ddH2O 8 μL，2×Taq Master Mix（Dye Plus）10 μL，ToCV-3R 0.5 μL（10 μmol/L），ToCV-3F 0.5 μL（10 μmol/L），cDNA 模板1 μL。PCR程序为：95℃ 5 min;95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环;72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，在凝胶成像系统上观察并记录结果，产物纯化回收并连接于克隆载体pGEM-T easy （Promega， USA），热激转化大肠杆菌DH5α后，挑取阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。利用BLAST（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）进行序列比对和分析。
　　1.3 烟粉虱生物型鉴定
　　烟粉虱单头DNA的提取：取3 μL蛋白酶K于封口膜上，单头烟粉虱置于其中，研磨成匀浆后移至加入20 μL 10 mg/mL的树脂溶液PCR 管中混匀，37℃孵育1 h，96℃ 10 min。
　　以WT-F和WT-R为引物[16]，对提取的烟粉虱DNA进行PCR扩增。扩增体系为20 μL：ddH2O 7 μL，2×Taq Master Mix（Dye Plus）10 μL，WT-F 1 μL，WT-R 1 μL（表1），模板1 μL。PCR程序：95℃ 5 min;95℃ 15 s，53℃ 45 s，72℃ 1 min，35个循环;72℃延伸10 min。取5 μL PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
　　酶切体系：ddH2O 7.5 μL，AseⅠ0.5 μL，缓冲液3.1X buffer 2 μL，加入10 μL PCR产物混匀后置于37℃孵育2～3 h。酶切后取5 μL产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。每次取20头烟粉虱检测，重复3次。
　　1.4 烟粉虱带毒情况的检测
　　从田间黄瓜上采集的烟粉虱中随机选取12头，进行多头烟粉虱的RNA提取，采用ToCV HSP70基因特异性引物 ToCV-3（表1）进行检测，重复3次，以明确烟粉虱样本是否携带ToCV。田间黄瓜上烟粉虱中随机选取20头，进行单头烟粉虱的RNA提取，重复3次，统计雌雄烟粉虱的带毒率。
　　1.5 供试植物和接种病毒
　　供试植物：黄瓜（品种为‘长春密刺’）种植在26℃±2℃，相对湿度75%±5%、光照周期 L∥D=16 h∥8 h的温室防虫笼中。为了确定ToCV能否系统感染黄瓜，将0.5 mL农杆菌侵染性cDNA克隆注射到三叶期的植物中[15]。共接种20株黄瓜，并以注射接种液作为对照。
　　2 结果与分析
　　2.1 田间样品症状
　　疑似感染ToCV的黄瓜主要表现为：叶片褪绿变黄，并随着症状的发展除了叶脉仍保持绿色外，几乎整个叶片全变黄色，叶片变脆且易折，同时还伴随部分叶片边缘卷曲等典型的ToCV症状（图1 a～c）。这与山东地区报道的ToCV引起的番茄病害特征类似[17]。基于病害特征和烟粉虱的发生，初步推测此次发现的黄瓜病害是由ToCV引起的病毒病。
　　
　　2.2 RT-PCR检测结果
　　利用ToCV HSP70基因特异性引物对采集的黄瓜样本进行RT-PCR扩增，PCR产物经电泳检测 （图2），60份样品中有39份样品被鉴定为ToCV阳性，包括37份显癥样品和2份未显症样品，检出率为65%。产物经过1%琼脂糖凝胶电泳后，显示扩增出大约450 bp的清晰条带，而健康黄瓜叶片阴性对照未检测到条带。
　　将PCR产物纯化回收后，连接到克隆载体，转化大肠杆菌后，每个样本取3个克隆进行测序。结果显示RT-PCR扩增结果为439 bp，在NCBI上进行BLAST比对，结果显示与KC887999.1的同源性最高，为99%。说明感染黄瓜的病毒为ToCV。
　　
　　2.3 烟粉虱生物型鉴定
　　对田间黄瓜叶背面采集的烟粉虱进行生物型鉴定，提取单头烟粉虱总DNA并进行PCR扩增，产物经AseⅠ酶切后分别得到500 bp和100 bp的两条带（图3），结果显示田间烟粉虱均为MED （Q）烟粉虱。
　　
　　2.4 烟粉虱带毒情况的检测
　　收集田间黄瓜叶背面的烟粉虱，每株黄瓜叶片随机选取12头进行多头烟粉虱的RNA提取，重复3次，进行ToCV的RT-PCR检测，PCR扩增得到大小为450 bp左右的特异性条带，与目标片段大小一致（图4）。此外，田间感病黄瓜上雌雄性烟粉虱随机各选取20头，采用ToCV HSP70基因特异性引物ToCV-3（表1）进行单头烟粉虱的ToCV检测，重复3次，统计得到雌性和雄性烟粉虱的平均带毒率分别为83.5%和 61.5%，雌性感染率高于雄性（表2）。
　　
　　2.5 室内接种ToCV感染黄瓜 　　与室内健康黄瓜相比，接种30 d后黄瓜表现出叶片黄化、脉间开始褪绿及叶边缘卷曲等番茄褪绿病毒感病症状（图1d）。对室内接种30 d后的黄瓜进行RT-PCR鉴定（图5），接种的20株黄瓜中有11株被鉴定为ToCV阳性，染毒率为55%。将PCR产物纯化回收后，连接到克隆载体，转化大肠杆菌后，每个样本取3个克隆送公司进行测序。结果显示RT-PCR扩增结果为439 bp，在NCBI上进行BLAST比对，结果显示与KC887999.1的同源性为99%。初步验证了ToCV对黄瓜的侵染性。
　　
　　3 讨论
　　本研究在湖南省蔬菜研究所基地黄瓜种植区采集叶片，利用 RT-PCR 方法检测疑似发病叶片，经序列分析比对，确认ToCV侵染黄瓜，这是ToCV侵染黄瓜的首次发现。自然条件下，多种植物病毒的复合侵染在田间作物上常有发生，很多重要的病毒病害也是多种病毒相互作用共同侵染导致的[18]。这些田间采集的黄瓜样品中，不排除其他病毒病原的存在，这也是导致室内接种ToCV的症状与田间症状有所出入的主要原因。此外，田间发病植株的带毒量较高，而室内接毒的病毒量较低，这也是造成室内接种与田间症状不符的原因。
　　在ToCV阳性的37份样品中，有2份无明显症状，表明黄瓜显症可能与ToCV的积累量或者浓度有关，或存在部分潜隐性侵染。ToCV在湖南黄瓜样品的检出率高达65%，这一较高的发病率，一方面对于黄瓜种植存在威胁;另一方面由于ToCV可以通过烟粉虱传播，对其他经济作物造成潜在威胁。这与先前的报道一致[19-20]。因此，对烟粉虱的监测有利于预防和控制该病毒的发生，减少其带来的危害。
　　番茄褪绿病毒具有多种寄主，除感染番茄、辣椒、马铃薯和其他茄科植物外，还可感染13属30种植物[2，21-22]。本研究发现的新寄主黄瓜，在农业上设施栽培面积较大，番茄褪绿病毒病一旦暴发，将导致黄瓜品质变差、产量下降，造成的经济损失严重影响农户的种植积极性。此外，在室内对黄瓜接毒的过程中发现，在病毒侵染后，黄瓜表现症状较晚，而在表现症状之前已经能够检测到病毒，这提醒我们在田间黄瓜可以保存番茄褪绿病毒的毒源，不容易被发现，且更容易造成番茄褪绿病毒在其他寄主上的扩散，应该重视在黄瓜上对番茄褪绿病毒病的提前检测。生产上对番茄褪绿病毒的防治应采取联防联控、综合防治。田间考察发现病毒病对黄瓜栽培品种的危害很严重，但目前尚未有根治病毒病的有效方法，病毒病的防治主要还是以预防为主。因此，本研究对于ToCV的预防和防治具有重要意义。
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　　（责任编辑： 田 喆）
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