地黄多糖对过氧化氢损伤大鼠脂肪间充质干细胞的保护作用

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　　摘要：目的：研究地黄多糖对过氧化氢损伤大鼠脂肪间充质干细胞（ADMSCs）的保护作用，为ADMSCs的应用提供实验依据。方法：分离、培养并鉴定大鼠脂肪间充质干细胞。取第3代ADMSCs，随机分为7组，A：H2O2损伤组；B、C、D、E、F分别为H2O2损伤加地黄多糖各浓度作用组（1mg/L、10mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L）；G：正常对照组，对应于分组，加入不同浓度地黄多糖培养24h，加250μmol/L过氧化氢（H2O2）作用2h，诱导ADMSCs损伤，然后用MTT法检测细胞存活情况，比色法检测细胞培养上清中乳酸脱氢酶（LDH）的水平。结果：A组与G组相比较存活细胞显著减少（P<0.01）、LDH水平明显增高（P<0.01）。地黄多糖各浓度组与A组比较，存活细胞显著增加，LDH水平明显降低，而且呈浓度依赖性。结论：地黄多糖可以抑制H2O2引起的ADMSCs减少和细胞培养上清中LDH含量的升高，减轻H2O2对ADMSCs的损伤，对ADMSCs具有保护作用。
　　关键词：地黄多糖；间充质干细胞；脂肪；过氧化氢；乳酸脱氢酶
　　中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2008)04-0755-03
　　
　　脂肪间充质干细胞（ADMSCs）即脂肪来源的间充质干细胞，是成体干细胞的一种。研究[1]表明ADMSCs具有很强的增殖分化能力，不仅可以自我更新，而且能够向骨、软骨、脂肪、神经、肌肉、内皮等方向分化，所以继骨髓间充质干细胞后，脂肪间充质干细胞成为干细胞移植治疗领域的又一研究热点。地黄多糖是中药地黄的主要有效成分，具有抗衰老、抗炎、保护心、脑、肾脏和胃黏膜等多种生物学作用[2-3]。本实验旨在将祖国的传统中药地黄多糖与ADMSCs研究结合起来，观察地黄多糖对过氧化氢（H2O2）损伤ADMSCs的影响，为ADMSCs的应用提供实验依据。
　　
　　1 实验材料
　　
　　DMEM培养基(Gibco)；胎牛血清(Gibco) ；Ⅰ型胶原酶(Sigma)；MTT(Sigma)；DMSO(Sigma)；胰蛋蛋白酶（粉剂，Amresco公司）；PBS平衡盐液（自配）；兔抗大鼠CD13、CD31、CD44、CD45、CD105等多克隆抗体、SABC免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒(武汉博士德生物有限公司)；地黄多糖（军事医学科学院毒物药物研究所）；过氧化氢（解放军总医院试剂室配置）。
　　
　　2方法
　　
　　2.1ADMSCs的分离 培养和鉴定取体重约200g的Wistar雄性大鼠，戊巴比妥腹腔注射麻醉，无菌条件下开腹，切取双侧附睾处脂肪，PBS清洗3次，剪碎，移入小三角烧瓶，加入0.08%胰酶消化10min后，再加入0.1%Ⅰ型胶原酶（用含10%胎牛血清的DMEM配置）继续消化40min，吸取消化液离心（1500r/min，5min），弃上清，加入约5mL PBS重悬、洗涤细胞，再次离心（同上），弃上清，用含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，接种，置入37℃，5% CO2培养箱(Heracus公司)中孵育，24h后首次换液。之后每3天换液，待细胞铺满培养瓶底约80%时传代，继续培养。对第3代细胞行免疫组织化学染色，鉴定其表面分子CD13、CD31、CD44、CD45、CD105等的表达。
　　2.2地黄多糖对H2O2损伤ADMSCs细胞存活情况的影响取第3代ADMSCs接种于96孔板（5×103个细胞/孔），37℃，5%CO2条件下培养24h贴壁，随机分为7组，A：H2O2损伤组；B、C、D、E、F分别为H2O2损伤加地黄多糖各浓度作用组（1mg/L、10mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L）；G：正常对照组。对应于分组，加入不同浓度地黄多糖继续培养24h后；加250μmol/L H2O2作用2h，然后用MTT法检测各组细胞存活情况，酶联免疫测定仪测定波长492nm处的吸光度，用吸光度值（OD值）来反应各组存活细胞的多少和细胞活性。
　　2.3地黄多糖对H2O2损伤ADMSCs乳酸脱氢酶（LDH）水平的影响取第3代ADMSCs接种于24孔板（2×104个细胞/孔），37℃，5%CO2条件下培养24h贴壁，分组同上，对应于分组，加入不同浓度地黄多糖继续培养24h后；加250μmol/L H2O2作用2h，取细胞培养上清，比色法检测各组LDH的水平。
　　2.4统计处理数据以均数±标准差表示,SPSS10.0软件进行分析，组间差异用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
　　
　　3结果
　　
　　3.1ADMSCs的培养 鉴定从脂肪组织中可以分离获得大量长梭形细胞，具有很强的增殖能力。原代细胞培养7天左右即可铺满培养瓶底70%～80%。传代后细胞仍保持旺盛的增殖能力，每3天即可铺满培养瓶底70%～80%；形态逐渐一致，细胞生长分布呈螺旋形或者旋涡形（见图1）。免疫组化染色CD13、CD44、CD105阳性；而CD31、CD45阴性（见图2～图4）。
　　
　　3.2地黄多糖对H2O2损伤ADMSCs细胞存活情况的影响结果见表1。250μmol/LH2O2作用ADMSCs2h后，可以引起OD值减小，与正常组比较有显著差异（P<0.01）。地黄多糖干预组H2O2引起的OD值减小不明显，与H2O2损伤组比较有显著差别（P<0.01）。
　　
　　3.3地黄多糖对H2O2损伤ADMSCs乳酸脱氢酶（LDH）水平的影响结果见图5。250μmol/L H2O2作用ADMSCs2h后，可以引起细胞培养上清中LDH水平的升高[（113.083±2.807）U/L]，与正常组[（85.800±0.424）U/L]比较差异有统计学意义（P<0.01）。而地黄多糖干预组LDH水平显著低于单纯H2O2损伤组（P<0.01）。
　　
　　
　　4讨论
　　
　　近年来随着我国人民生活水平不断提高，心脑血管疾病、糖尿病等的发病率也不断升高，逐渐成为危害人们生命和健康的主要疾病。广大医务工作者在不断地探索更加有效的治疗方法，在开发新的药物和辅助器械的同时，积极关注细胞治疗，希望从根本上修复受损的组织器官，彻底解除患者的病痛。
　　干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的特殊细胞，理论上可以实现组织器官的再生。目前研究的干细胞分两类：胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞由于受到伦理学问题、取材困难以及免疫排斥等因素限制，给临床研究和应用带来很多困难。而成体干细胞虽然分化能力相对减弱，但可以自体移植，从而避免了免疫排斥等上诉问题。ADMSCs是成体干细胞的一种，来源于脂肪组织，与已经广泛研究的骨髓间充质干细胞相比，在分化潜能、表面抗原等方面十分相似，但又具有来源充足、取材方便、体外扩增时间短等优势，所以成为了干细胞研究领域的又一热点。

　　目前研究[1,4-5]已经证明ADMSCs可以成功分化为骨、软骨、骨骼肌、心肌、血管内皮、脂肪、神经等组织细胞，并且可以作为目的基因的载体[6]，移植后可以改善相应的机体功能。2006年Timper K等[7]报道，ADMSCs可以成功诱导分化为分泌胰岛素的细胞。但ADMSCs在实际应用中还有许多问题有待进一步研究：如ADMSCs移植到体内或梗死区后能否继续存活，怎样提高移植细胞在梗死区的存活率；ADMSCs在梗死区能够起到修复组织、改善功能的作用，具体机制是什么； ADMSCs发育的基因调控和微环境影响等问题还需要系统的研究。
　　过氧化氢（H2O2）是一种强氧化剂，在Fe2 + 、Cu2 +等金属离子存在下，与超氧阴离子反应生成羟自由基•OH，从而引发脂质过氧化，导致细胞损伤。 LDH水平的升高是细胞受损的一个敏感指标，细胞释放LDH增加通常反映细胞受损、细胞膜通透性增加[8]。研究[9]发现在心肌缺血和缺血再灌注损伤时H2O2生成明显增多，使损伤进一步加重。本实验用H2O2作用于ADMSCs，模拟ADMSCs移植到心肌梗死区的损伤，加用地黄多糖干预，通过检测细胞存活情况和培养上清中LDH的水平，来观察地黄多糖对H2O2损伤ADMSCs是否具有保护作用，探索提高ADMSCs在有害环境中存活的有利因素，为ADMSCs的临床应用提供实验依据。
　　地黄多糖是中药地黄的主要有效成分，从地黄的根茎中提取，具有促进造血细胞增殖、增强免疫力、抗衰老、保护心、脑、肾脏和胃黏膜等多种生物学功能[10-12]。研究[13]表明地黄提取物可以不同程度的对抗肝微粒体脂质过氧化，其机理可能是通过提高血中的抗氧化相关酶，如―氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)等的活性,从而降低组织的过氧化脂质水平。本实验选取不同浓度地黄多糖作用于ADMSCs 24h，然后各组均加入250μmol/LH2O2继续培养2h，观察地黄多糖对H2O2损伤ADMSCs的影响。
　　实验初步发现250μmol/LH2O2作用ADMSCs2h后，损伤组与正常对照组相比OD值明显减小（P<0.01），细胞培养上清中LDH水平显著升高（P<0.01），提示H2O2引起ADMSCs明显损伤。而地黄多糖预处理可以明显抑制H2O2引起的ADMSCs减少，提高ADMSCs的存活率；同时抑制H2O2损伤所致LDH水平的升高，对ADMSCs起到保护作用。并且初步观察到地黄多糖的作用呈浓度依赖性，在本实验地黄多糖所选浓度中200mg/L对ADMSCs的保护作用最明显，但是继续增加浓度，是否会有更大的保护作用，还需要进一步研究。
　　本实验在成功分离培养ADMSCs的同时，用H2O2作用于ADMSCs，模拟ADMSCs移植到心肌梗死区的损伤，观察了地黄多糖对H2O2损伤ADMSCs的影响。初步证明了地黄多糖对H2O2损伤ADMSCs具有保护作用，为ADMSCs早日应用于临床提供了重要的实验依据。
　　
　　参考文献
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