甜瓜再生体系研究进展

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　　摘    要：20世纪70年代以来，以细胞工程和基因工程为主题的现代生物技术应用于作物品种改良，把育种技术从宏观水平提高到微观水平，为品种改良提供了一条全新途径。在甜瓜品种改良过程中，建立高效的甜瓜再生体系是甜瓜细胞工程和基因工程中的关键性基础工作。对甜瓜进行遗传转化研究首先要建立一套甜瓜的离体再生体系。文章综述了甜瓜再生体系建立的过程中，外植体基因型、部位、生理年龄、培养基组成、激素种类和浓度等主要因素对植株再生的影响，分析了目前甜瓜再生体系在建立中存在的问题，并展望了再生体系技术的应用前景，旨在为甜瓜再生体系的研究提供理论依据。
　　关键词：甜瓜;再生体系;外植体
　　Abstracts： Since 1970s， modern biotechnology with cell engineering and genetic engineering as its theme has been applied to crop variety improvement， raising breeding technology from macro level to micro level， providing a new way for variety improvement. In the process of variety improvement of melon， the establishment of efficient regeneration system is the key in melon cell engineering and genetic engineering. In order to study the genetic transformation of melon， we must first establish a set of in vitro regeneration system of melon. In this paper， the effects of main factors such as explant genotype， location， physiological age， medium composition， hormone type and concentration on plant regeneration in the process of establishing the regeneration system of melon were summarized， the existing problems in the establishment of the regeneration system of melon were analyzed， and the application prospect of the regeneration system technology was prospected， aiming to provide theoretical basis for the research of the regeneration system of melon.
　　Key words： Melon; Rregeneration system; Explants
　　甜瓜（Cucumis melo L.）甘甜如蜜，香味濃郁，营养丰富，是国际市场畅销的十大水果之一。随着人们生活水平的逐渐提高，人们对甜瓜品质的要求越来越高，因此，生产上急需丰产、优质、特色甜瓜新品种，但由于常规育种周期长、工作量大且易受环境因素影响。近年来，随着分子生物学的发展，运用生物技术进行种质创新已成为甜瓜育种的最新途径。甜瓜遗传转化研究过程中，高效再生体系的建立是转化成功的首要环节。目前，已有很多关于甜瓜离体再生的报道。笔者就甜瓜离体再生的途径、影响因素及存在的问题和未来发展前景进行了展望，旨在为甜瓜离体培养再生体系的研究提供一定的理论指导依据[1]。
　　1 外植体基因型
　　Ficcadenti等[2-3]研究表明，基因型是影响甜瓜组织培养进而获得再生体系的一个内部因素，不同的甜瓜品种基因型不同，其外植体获得再生体系的能力也不同。蔡润等[4]认为，不定芽的再生能力是受基因型控制，材料本身的基因型影响了其对外源激素诱导作用的敏感性，还可能存在基因型间的互补作用。甜瓜基因型各异[5-6]，不定芽的再生频率也差异显著。付秋实等[7]证实，薄皮甜瓜诱导率明显高于厚皮甜瓜。陶兴林等[8]研究认为，薄皮甜瓜‘甘甜一号’再生能力强于厚皮甜瓜‘绿宝石’。张慧君等[9]以纯合自交系‘M1-15’‘M1-16’‘M1-19’‘M1-23’的子叶节为材料，研究表明，不同基因型甜瓜之间的再生频率差异较大，其中‘M1-15 ’甜瓜自交系为最佳基因型。陶兴林[10]等选用‘绿宝石’‘西域1号’‘白兰瓜’等6份厚皮甜瓜材料研究，表明以‘绿宝石’的不定芽生频率最高，‘西域1号’次之，而‘白兰瓜’不定芽发生频率最低。于喜艳等[11]以厚皮甜瓜‘状元’‘伊丽莎白’，薄皮甜瓜‘新玉’‘白玉’的子叶为材料，研究表明，薄皮甜瓜的子叶组织培养再生能力明显强于厚皮甜瓜。由此可见，基因型的选择对甜瓜再生频率影响较大，选择适合组织培养的基因型是试验顺利进行的保障。
　　2 外植体部位
　　有研究报道表明，不同外植体之间的再生能力差异显著，同一外植体不同部位的再生能力也有很大差异[12]。乔永旭[13]研究了‘鑫福999’品种不定芽的诱导率高低顺序为：子叶>真叶>下胚轴，并且下胚轴诱导出的愈伤组织玻璃化比例大。孔维萍等[14]研究认为，5～7 d苗龄的子叶近胚轴端具有较高的诱导率，而根尖不能诱导愈伤组织的形成。赵燕等[15]研究认为，以子叶作为外植体诱导愈伤组织，3～5 d后子叶即明显增大增厚，为原来的2～3倍，同时发生卷曲，叶脉处颜色变淡;下胚轴形成愈伤组织的情况与子叶相似，只是时间略有后移，说明这2种外植体均为甜瓜诱导愈伤组织的良好材料。肖守华等[16]研究认为，茎尖和子叶切块的不定芽诱导率均较高，而茎段、下胚轴、真叶诱导不定芽分化很低或根本诱导不出不定芽。马国斌等[17]研究认为，未成熟子叶是甜瓜离体培养的最佳外植体，不仅再生能力强，不定芽分化率高，而且对培养基的适应性也较广。毛娟等[18]以厚皮甜瓜‘黄河蜜3号’近轴端、远轴端子叶及下胚轴为外植体为试验材料，研究发现，甜瓜外植体类型之间的分化水平差异很大，下胚轴和远轴端子叶不能分化不定芽，而6 d苗龄的近轴端子叶膨大明显，产生大量不定芽，芽体单独成苗的数量较多。李晓慧等[19]以网纹甜瓜‘众云-18’4 d苗龄的子叶近胚轴端、子叶远胚轴端和下胚轴为试验材料，结果表明，子叶近胚轴端诱导率最高，不定芽多发生在子叶与胚轴连接处;而子叶远胚轴端为外植体子叶变黄老化，不定芽再生率较低;下胚轴为外植体，几乎没有不定芽的产生。由此可见，甜瓜再生以子叶近轴端为外植体较适宜。 　　3 外植体生理苗龄
　　甜瓜诱导不定芽过程中，外植体苗龄是重要影响因素之一，由于外植体生理年龄不同，愈伤组织的诱导率和生长速率有明显的差别。贾卓男等[20]研究认为，取苗龄为5 d的‘顶峰3号’甜瓜子叶为外植体，其不定芽的诱导率最高。杜姗姗等[21]研究认为，取苗龄为5 d的新疆甜瓜‘伽师’子叶为外植体，其不定芽的诱导率最高。侯丽霞等[22]研究证实，取苗龄为4～6 d的‘鲁薄1号’（自交系）甜瓜子叶柄为外植体，不定芽分化率最高，其他苗龄无菌苗的子叶柄分化率较低。施先锋等[23]报道，在相同的诱导培养基中，4 d苗龄的子叶诱导不定芽数目最多，7 d苗龄的子叶诱导不定芽数目最少。田芳等[24]取‘黄旦子’甜瓜子叶为外植体，研究不同日龄子叶对不定芽诱导率的影响，其中2～8 d的子叶基部均能诱导出不定芽，而2 d的子叶诱导率最高，达到了80%;随着日龄的增加，诱导率逐渐降低，第10天时的子叶则完全不能诱导产生不定芽，因此确定2 d龄时由黄变绿的子叶为最佳外植体。池慧芳等[25]研究认为，以甜瓜品种‘红城7号’为试验材料，种子消毒后接种于MS培养基上，在25 ℃培养箱暗培养3 d后，取子叶为外植体，接种到诱导培养基上，外植体不定芽分化率最高。
　　4 培养基类型
　　在甜瓜组织培养过程中，培养基的选择是影响外植体诱导的关键因素之一。甜瓜组织培养中常用的培养基为MS培养基，部分学者运用BM3、Miller等培养基。王爱玲等[26]研究表明，以甜瓜‘红心脆’和‘早皇后’子叶为外植体，在1/2 MS培养基中均适宜生根，根粗壮且分枝多，繁殖数较高。黄丹枫等[27]以网纹甜瓜‘夏七号’无菌苗的子叶、胚轴为试验材料，接种于改良MS培养基（用N6的大量元素代替MS的大量元素）上，其愈伤组织诱导率分化率均为最高。张铁刚等[28]以厚皮甜瓜‘皇后’为试验材料，将无菌苗接种于MSB（MS盐溶液和B5培养基的有机成分）培养基中，其丛生芽诱导率最高，达86%。盛慧等[29]以‘哈研3号’薄皮甜瓜为试验材料研究发现，外植体在含有Agar 1.0%的1/2MS培养基中生根率最高。王建设等[30]认为，‘伊丽莎白’子叶在BM3（MS盐溶液、3 g·L-1蔗糖、100 mg·L-1肌醇、1 mg·L-1维生素B1）培养基中不定芽诱导率最高。丁海涛等[31]研究认为，在Miller培养基中，‘伽师瓜’子叶诱导率为40%～60%之间，而再生苗的诱导率最高，為90%。孙兰英等[32]认为，当植株根系发达后，进行移栽，移栽前进行驯化处理可提高成活率，移栽前将再生苗转移至蛭石培养基上，可促进叶片伸展、根系生长，且移栽时不易伤根，缩短了缓苗时间，从而大大提高成活率。在组织培养过程中，由于不同基因型、不同外植体之间的内源激素种类和浓度不尽相同，因此，在培养过程中，培养基的选择，是甜瓜再生体系顺利建立的前提。
　　5 生长调节剂的种类及浓度
　　植物生长调节剂种类及浓度是影响外植体分化的重要因素之一，由于不同品种甜瓜的基因型存在差异，不同甜瓜品种的外植体在含有不同种类和浓度生长调节剂的培养基中的诱导率不尽相同。王建设等[30]研究认为，以伊丽莎白子叶为外植体，接种于MB3+IAA1.5 mg·L-1+KT6.0 mg·L-1+CuSO4·5H2O 1.0 mg·L-1诱导培养基中，其愈伤组织诱导率最高。丁海涛等[31]将成熟甜瓜种子无菌苗的子叶接种于含有Miller+6-BA 5.0 mg·L-1+ZT 0.01 mg·L-1+3%蔗糖的培养基中，其子叶愈伤组织诱导率最高。付秋实等[33]将薄皮甜瓜‘IVF05’子叶接种于诱导培养基MS+6-BA 1.0 mg·L-1+ABA 0.5 mg·L-1中，在此培养基上产生的愈伤组织比较少，能正常分化的不定芽较多并明显伸长，不定芽生长较快。王爱玲等[34]研究认为，诱导培养基MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IAA 0.5 mg·L-1和MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IAA 1.0 mg·L-1，最有利于甜瓜‘黄醉仙’下胚轴诱导愈伤组织。田芳等[24]研究认为，以‘黄旦子’为试验材料研究发现，苗龄为2 d的子叶接种于MS+6-BA 1.2 mg·L-1+IAA 0.5 mg·L-1诱导培养基中，其不定芽诱导率最高。池慧芳等[25]将3 d苗龄的‘红城7号’子叶接种于含有MS+6-BA 2.0 mg·L-1+2，4-D 0.1 mg·L-1培养基中，其子叶愈伤组织诱导率最高。张竞秋等[35]研究认为，取5～7 d苗龄的‘河套蜜瓜’子叶为外植体，接种于MS+6-BA 0.5 mg·L-1+IAA 1.0 mg·L-1培养基中，其愈伤组织诱导率最高。张铁刚等[28]研究认为，以新疆甜瓜‘皇后’子叶为外植体，接种于MS+6-BA 1.0 mg·L-1诱导培养基中，其愈伤组织诱导率最高。褚丽敏等[36]研究表明，网纹甜瓜‘顶峰3号’试管苗在MS+6-BA 0.4 mg·L-1+IBA 0.05 mg·L-1培养基中最适合增殖培养，发现影响玻璃苗形成的主要因素是6-BA浓度，相对不同浓度的IBA影响较少，从诱导率、生长势及玻璃化现象的发生等综合因子分析，1 L培养基添加0.2～0.4 mg BA、0.05 mg IBA较为适宜。Baruch Leshem等[37]研究发现，在以子叶为外植体，研究根系再生过程中，加入钙离子拮抗剂Nifedipin（硝苯地平）总是能抑制根系的生长，研究表明，钙离子在根系生长发育过程中起着至关重要的作用。R.C. Yadav等[38]研究证实，将甜瓜子叶接种于MS+6-BA 0.05 mg·L-1（琼脂糖含量0.8%）培养基中，有利于不定芽的生长和伸长，而最适合生根培养基为MS+NAA 0.01 mg·L-1（琼脂糖含量0.8%）。Yan Zhao等[39]研究表明，适合子叶诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+6-BA 1.5 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1，最适生根培养基为MS+ZT 1.0 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1。 　　6 问题和展望
　　随着科学技术的发展和组培条件的改善，甜瓜离体组织培养技术更多的应用于新品种改良和生物育种等方面。经过近几十年的发展，甜瓜离体组织培养和再生体系的研究已取得了很大进展[39]，但仍有一些问题急需解决。虽然甜瓜组织培养已经取得很大进展，但是试验只能在实验室进行，和常规营养体繁殖相比成本高，难以实现工厂化育苗，因此在甜瓜组织培养过程中，基因型、外植体、生长调节剂的选择和控制方面还有待进一步研究，以提高甜瓜再生苗繁殖系数并降低繁殖成本。不同基因型甜瓜再生差异较大，今后工作应扩大试验材料和生长调节剂的浓度范围，找到适合甜瓜品种再生的通用生长调节剂的浓度范围;在甜瓜组织培养过程中，外植体的选择是甜瓜再生的关键因素之一，前人[9，11，23]研究表明，以甜瓜子叶为外植体，其愈伤组织诱导和不定芽分化率最高，而胚轴分化能力较低，因此，今后的工作应改善试验条件，摸索一套适合甜瓜胚轴繁殖的再生体系。还应该把甜瓜组织培养与细胞工程、基因工程有机结合，以求缩短育种年限，创造出更多的有价值的种植资源，并应用于品种改良中。在今后的甜瓜再生体系建立的过程中，应制定一套适应性广的试验手册，包含不同种类和浓度的生长调节剂水平，培养基的配方等，力求提高不同基因型甜瓜外植体的再生能力。
　　近几年来，随着基因工程和分子生物学的深入发展，更多的科技推动着组织培养技术的向前发展，甜瓜离体再生体系会不断完善[1]。运用甜瓜组织培养等先进技术手段进行种质创新，进而实现甜瓜品质改良，已经成为甜瓜遗传育种研究的新途径，也为进一步进行甜瓜转基因等方面的研究提供技术保障。高效的甜瓜离体再生体系将在未来育种工作方面有着广阔的应用前景[40]。
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