梅州地区柑橘黄龙病的常规PCR与实时荧光定量PCR检测技术研究与应用

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　　摘要    本文利用TaqMan探针实时荧光定量PCR（qPCR）检测技术对梅州地区疑似柑橘黄龙病样品进行检测，并与常规PCR检测进行对比。结果表明，实时荧光定量PCR用于检测柑橘黄龙病菌结果快速、准确、可靠且无污染。采用2种方法对梯度稀释的阳性样本进行检测发现，实时荧光定量PCR的灵敏度较常规PCR更高，能够检出样品中痕量的病原菌。本研究在梅州地区建立了以实时荧光定量PCR方法进行柑橘黄龙病疑似植株的检测，可以为梅州地区提供更准确、更灵敏、快速的黄龙病检测技术。
　　关键词    柑橘黄龙病;实时荧光定量PCR;灵敏度;广东梅州
　　中图分类号    S664.4        文献标识码    A
　　文章编号   1007-5739（2020）08-0103-03                                                                                     開放科学（资源服务）标识码（OSID）
　　Abstract    In this paper，TaqMan probe real-time quantitative PCR（qPCR）detection technology was used to detect suspected citrus huanglongb-ing samples in Meizhou area，and compared with conventional PCR detection.The results showed that real-time fluorescent quantitative PCR for detecting citrus huanglongbing was fast，accurate，reliable and free pollution.Two methods were used to detect the gradient-diluted positive samples，which showed that the sensitivity of real-time quantitative PCR was higher than that of conventional PCR，and it could detect trace amounts of pathogenic bacteria in the samples.This study established a real-time quantitative PCR method to detect suspected citrus Huanglongbing plants in Meizhou area，which could provide more accurate，sensitive and rapid Huanglongbing detection technology in Meizhou area.
　　Key words    citrus huanglongbing;real-time fluorescent quantitative PCR;sensitivity;Meizhou Guangdong
　　柑橘作为重要的经济作物之一，广泛分布在热带和亚热带地区，产量居于世界水果之首[1]。梅州市作为全国最大的柚类生产基地，生产区域覆盖了所辖的梅江区、梅县区、大埔县、兴宁市、五华县等共65个镇[2]。随着种植面积的不断扩大，其病虫害问题也接踵而至，其中最为严重的是柑橘黄龙病（cirtus huanglongbing，HLB）。柑橘黄龙病病原菌隶属于韧皮部杆菌属（Candidatus Liberobacter），分为亚洲种（Can-didatus Liberibacter asiaticus）、非洲种（Candidatus Liberibacter africanus）和美洲种（Candidatus Liberibacter americanus）[3-4]，其传播方式主要为柑橘木虱传播、嫁接传播和运输传播3种方式。
　　柑橘黄龙病在田间的症状表现复杂难辨，其典型症状为叶片斑驳黄化、红鼻子果、新梢均匀黄化等。目前，国内外对柑橘黄龙病的检测方法除了田间症状诊断外，还有嫁接诊断、生化和电镜检测、血清学检测以及分子生物学检测等[5]。分子生物学检测方法因其准确度和灵敏度高、操作简便、检测快速等被广泛用于柑橘黄龙病的诊断。常用的PCR检测方法包括常规PCR、巢式PCR以及实时荧光定量PCR等3种方法。
　　本文利用TaqMan探针实时荧光定量PCR体系对梅州地区疑似柑橘黄龙病样品进行检测。TaqMan探针使用杂交探针，特异性高且可靠，由于实时荧光定量PCR的扩增片段小、灵敏度好、稳定性高、不易受外界污染、操作简便等优势，使实时荧光定量PCR比常规PCR更适用于检测柑橘黄龙病疑似样本。
　　1    材料与方法
　　1.1    试验材料 　　植物样品主要来自梅州各个县区的柑橘种植园，植株叶片出现原因不明的黄化现象。阴性对照为梅州市农业科学院柑橘无病毒苗木繁育基地的健康植株。
　　1.2    试验方法
　　1.2.1    植物总基因组DNA的提取。柑橘植株总基因组的提取方法参照天根生物公司高效植物基因组DNA提取试剂盒，并根据实际情况进行简单修改。称取0.1 g新鲜柑橘叶脉，用剪刀剪碎后放入2 mL离心管中，加入400 μL缓冲液FGA和6 μL RNaseA（10 mg/μL），置于组织研磨机（MP Fast-Prep-24）中高速振荡研磨25 s，后续提取程序参照基因组提取试剂盒说明书[6]。
　　取2 μL 提取的基因组DNA 在超微量分光光度计（Na-noDrop One）上检测样品浓度及纯度，剩余样品置于-20 ℃冰箱贮藏备用。
　　1.2.2    引物。利用柑橘黄龙病病原亚洲种的16S rDNA设计合成引物，由上海生物工程技术服务有限公司合成，具体见表1、2。
　　1.2.3    常规PCR。常规PCR的扩增体系为25 μL，其中DNA模板1.0 μL，引物 OI1和OI2c各1.0 μL，2xPCRmaster Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反应程序为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，退火温度60 ℃，72 ℃ 60 s，共35个循环，72 ℃延伸10 min。空白对照为ddH2O，阴性对照为梅州市农业科学院柑橘无病毒苗木繁育基地健康植株提取的基因组DNA，阳性对照为带病植株基因组DNA。PCR扩增完成后，取6.0 μL扩增产物，以5.0 μL DNA Marker（DL 2000，TAKARA）为标记进行1%琼脂糖凝胶电泳，电压100 V，时间35 min。电泳结束后在凝胶成像系统下观察结果，如在1 167 bp（OI1/OI2c为引物）处出现扩增条带，则该样品为阳性，该植株感染黄龙病。
　　1.2.4    实时荧光定量PCR。实时荧光定量PCR的扩增体系为20 μL，其中DNA模板2.5 μL，引物HLB asf和HLB asr各0.5 μL，HLB Probe 0.25 μL，Master Mix 10 μL，ddH2O 6.5 μL。反應程序在实时荧光定量PCR仪（StepOnePlus）上进行，在95 ℃条件下预变性30 s，95 ℃ 10 s，60℃ 10 s，60 ℃ 20 s同步多次采集荧光，共40个循环。空白对照为ddH2O，阴性对照为梅州市农业科学院柑橘无病毒苗木繁育基地的健康植株提取的基因组DNA，阳性对照为带病植株基因组DNA。检测结果以反应管内荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数（即 CT值）显示，CT值≤35表示该样品为黄龙病阳性，CT值>35为阴性，CT值越低，则表明黄龙病菌含量越高。
　　1.2.5    实时荧光定量PCR与常规PCR灵敏度对比。取同时通过1.2.3和1.2.4方法检测确定为阳性的样品，通过超微量分光光度计对其基因组DNA浓度进行检测，确定样品基因组DNA的浓度，并进行梯度稀释，分别用常规PCR和实时荧光定量PCR对稀释后的系列样品进行检测。
　　2    结果与分析
　　2.1    柑橘总DNA的提取及含量检测
　　以疑似感染黄龙病植株叶片的叶脉为材料提取基因组DNA，基因组DNA的A260/A280比值在1.6～1.9之间，提取效果较好，可用于后续PCR扩增。
　　2.2    柑橘黄龙病常规PCR检测与实时荧光定量PCR检测结果
　　为了评价常规PCR方法与实时荧光定量PCR方法检测结果的符合程度，用以上2种方法分别对梅州市各县区采集的疑似黄龙病样品共40个进行检测，检测结果见图1、2及表3。
　　给常规PCR检测发现，9个样品在1 167 bp处扩增出特异性电泳条带，阴性对照、空白对照在此位置无特异性扩增条带;实时荧光定量PCR检测发现，12个样品的CT值≤35，即为黄龙病阳性，阴性对照、空白对照无CT值。对比检测结果，只要实时荧光定量PCR检测为阳性的样品，常规PCR全为阳性，表明实时荧光定量PCR用于检测柑橘黄龙病菌结果快速、准确、可靠且无污染，同时避免了使用有害物质。
　　2.3    实时荧光定量PCR与常规PCR灵敏度对比
　　取同时通过常规PCR和实时荧光定量PCR方法检测确定为阳性的样品，通过超微量分光光度计确定样品基因组 DNA浓度，并进行梯度稀释，结果见表4。分别用常规PCR和实时荧光定量PCR对稀释后的系列样品进行检测，结果如图3所示。可以看出，在相同稀释倍数下，常规PCR检测为阴性的样品实时荧光定量PCR检测结果为阳性，表明实时荧光定量PCR的灵敏度较常规PCR更高，能够检出样品中痕量的病原菌。
　　3    结论与讨论
　　本实验室在梅州地区建立了柑橘黄龙病PCR快速检测技术[6]，在检测筛查过程中发现，同样的植株，半年前检测结果为阴性，在半年后的检测中呈阳性，显示常规PCR检测技术对黄龙病感染初期的检出率较低。因此，本研究建立了以实时荧光定量PCR方法进行柑橘黄龙病疑似植株的检测，可以为梅州地区提供更准确、更灵敏、更快速的柑橘黄龙病检测技术。
　　由于柑橘品种种类繁多，在田间情况下感染黄龙病的表现形式不一而同，不同病害、药害、缺素等表现症状也给田间诊断黄龙病增加了难度，且黄龙病菌在植株体内含量分布不均匀，因而常导致误诊。而PCR技术的快速、灵敏、准确等优点使其成为当前检测柑橘黄龙病的主要手段。常规PCR成本较低，多适用于大规模的田间初次普查检测;实时荧光定量PCR适合对常规PCR没有检出的疑似样品进行进一步的检测确认，或对黄龙病菌侵染早期、含菌量较低的样本，如种苗、接穗等进行检测。
　　在实际应用中，可结合田间诊断，通过“红鼻子果”以及叶片斑驳黄化这2个特征对柑橘黄龙病进行形态学鉴定[8]，并通过常规PCR以及实时荧光定量PCR检测技术进行进一步确认。
　　4    参考文献
　　[1] 邓秀新.世界柑橘品种改良的进展[J].园艺学报，2005，32（6）：1140-1146.
　　[2] 李月，张志标，钟进良，等.梅州柚产业现状及发展对策[J].现代农业科技，2019（3）：75-78.
　　[3] TEXEIRA D C，AYRES J，KITAJIMA E W，et al.First report of a huangl-ongbing-like disease of citrus in Sao Paulo State，Braziland association of a new liberibacter species，"Candidatus Liberibacter americanus"，with the disease[J].Plant Disease，2005，6：89-107.
　　[4] 胡文召，周常勇.柑橘黄龙病病原研究进展[J].植物保护，2010，36（3）：30-33.
　　[5] 胡浩.应用荧光定量PCR技术研究亚洲韧皮部杆菌在寄主体内的动态变化及分布[D].重庆：重庆大学，2007.
　　[6] 张志标，李月，黄城，等.梅州地区柑橘黄龙病的PCR快速检测[J].东南园艺，2018（5）：19-22.
　　[7] WENBIN LI，JOHN S，HARTUNG，LAURENE LEVY.Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associate with citrus huanglongbing[J].Journal of Microbiological Methods，2006（66）：104-115.
　　[8] 吴礽超，赵小龙，王明召.柑橘黄龙病检测技术概述[J].广西园艺，2007，18（6）：59-60.
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