黑皮鸡枞液体菌种发酵罐培养条件的优化

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　　摘要：【目的】優化黑皮鸡枞液体菌种发酵罐培养条件，为大规模培养黑皮鸡枞液体栽培菌种及提高黑皮鸡枞菌产量和品质提供参考依据。【方法】采用液体发酵罐培养技术，以黑皮鸡枞液体菌种的菌球直径、均匀度、菌丝干重、漆酶、纤维素酶和多酚氧化酶活性为指标，通过单因素试验和均匀试验，优化碳（C）源、氮（N）源、碳氮添加量比（C/N）、接种量、装液量、培养温度和培养时间，筛选出黑皮鸡枞液体菌种发酵罐培养的最佳培养基和发酵工艺，并开展液体菌种栽培试验。【结果】黑皮鸡枞液体菌种发酵罐培养的最佳培养基为20.0 g葡萄糖+4.0 g高粱粉+3.0 g K2HPO4+1.0 g MgSO4+2片维生素B1+1000.0 mL蒸馏水，pH 6.5;发酵工艺：装液量12 L，接种量12%，培养温度25 ℃，转速90 r/min，培养时间100 h，罐压0.3 MPa，通气量0.9 m3/h。栽培试验结果表明，在最佳培养基和培养工艺条件下获得的液体菌种其栽培黑皮鸡枞菌丝生长速度快，满袋时间为29 d，平均每袋产量约360.0 g，生物学转化率达78.0%。【结论】将液体菌种发酵罐培养技术与工厂化栽培技术有机结合，可实现黑皮鸡枞菌的规模化、标准化、现代化和工厂化生产。
　　关键词： 黑皮鸡枞;液体菌种;发酵罐培养
　　中图分类号： S646.9                            文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）02-0344-06
　　Abstract：【Objective】The culture conditions of fermenting tanks for Oudemansiella  raphanipes liquid strain were optimized，which provided reference for large-scale cultivation of liquid culture strains and the improvement of the yield and quality of O. raphanipes. 【Method】Using liquid fermenter culture technology，the ball diameter，uniformity，dry weight of the mycelium，laccase activity， cellulase activity and polyphenol oxidase activity of the liquid strain of O. raphanipes were used as indicators. Through single factor and uniform experiments，optimized carbon（C） source，nitrogen（N） source，carbon and nitrogen add ratio（C/N），inoculum amount，volume of liquid，culture temperature and incubation time， the optimum medium and fermentation process of O. raphanipes liquid strains were screened，and the cultivation experiment of liquid strain was carried out. 【Result】The best medium for fermentation of O. raphanipes liquid strains by fermenter：glucose 20.0 g+sorghum powder 4.0 g+K2HPO4 3.0 g+MgSO4 1.0 g+vitamin B1 2 tablets+distilled water 1000.0 mL，pH 6.5. Fermentation process：liquid content 12 L，inoculation amount 12%，culture temperature 25 ℃，stirring speed 90 r/min，culture time 100 h，tank pressure 0.3 MPa，ventilation volume 0.9 m3/h. The results of the cultivation experiment showed that the mycelium of the O. raphanipes cultivated in the liquid culture under the optimal medium and the optimum process conditions had a fast growth rate，the mycelium full bag time was 29 d，and the average yield each bag was about 360.0 g. The biological conversion rate reached 78.0%. 【Conclusion】It is possible to realize the large-scale，standardized and modern industrial production of O. raphanipes by combining the liquid strain fermenter production technology with the industrial cultivation technology. 　　Key words： Oudemansiella raphanipes; liquid strain; fermenter culture
　　0 引言
　　【研究意义】黑皮鸡枞（Oudemansiella raphanipes）属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、伞菌科，是珍稀且药食用价值极高的食用菌，与松茸、羊肚、黑虎掌同列为我国四大名菌，被誉为菌中之冠（Kirk et al.，2001;Saha，2008;付子艳和李荣春，2009）。目前，液体菌种发酵罐培养技术已广泛应用于食用菌生产，但仍存在菌丝质量差、菌球生产时间长及菌球大小不均匀等缺点。食用菌的菌种质量直接关系到产量和质量，而在实际生产中对黑皮鸡枞液体菌种培养条件尚不完全清楚。因此，优化黑皮鸡枞液体菌种发酵罐培养条件，对实现黑皮鸡枞大规模栽培及提高黑皮鸡枞菌的产量和品质具有重要意义。【前人研究进展】目前，国内关于鸡枞菌液体菌种培养的研究主要集中在摇瓶培养条件筛选等方面，而与发酵罐培养技术相关的研究较少。胡忠策和郑晓冬（2002）对鸡枞菌发酵培养基进行优化，结果表明，当培养基组成为4.29%大米水解糖、0.31% KH2PO4、0.53%酵母粉和pH 4.5时，在28 ℃、150 r/min条件下培养5 d，鸡枞菌的生物量达19.8 g/L。胡尚勤等（2008）研究发现，鸡枞菌菌丝体在碳（C）源为葡萄糖、氮（N）源为氨基酸时，最适C∶N为12～14∶1。罗晓妙（2010）研究表明，利用天然营养培养基筛选出较适宜鸡枞菌菌丝体生长的摇瓶培养基配方为玉米粉20.0 g/L+麸皮10.0 g/L+少量维生素B1（VB1）和维生素C（Vc），在此培养基基础上的培养条件为pH 4.5、温度27 ℃、转速90 r/min。曾先富等（2012）研究发现，在25～33 ℃、pH 6.0～7.0、以葡萄糖为C源、酵母膏为N源的培养基上，鸡枞菌菌丝生长速度快，菌丝粗壮、浓白、致密。熊亚和李敏杰（2013）采用响应面试验研究C源、N源和生长因子对鸡枞菌菌丝体产量的影响，结果表明，在添加20.233 g/L葡萄糖、2.146 g/L蛋白胨和0.149 g/L维生素B6的培养基中菌丝体干重最重。薛林浩等（2013）研究发现，pH、麸皮、玉米粉、大豆粉、K2HPO4和MgSO4对液体发酵的黑皮鸡枞生物量和形态均有较明显影响。徐兵等（2017）研究认为，黑皮鸡枞菌种摇瓶液体发酵最适条件为培养溫度26 ℃、转速175 r/min、pH 7.6、发酵周期25 d。李艳丽（2018）研究发现，秦岭地区野生鸡枞菌菌丝摇瓶液体培养最佳营养条件为2.15%葡萄糖、0.22%酵母膏、20.00%马铃薯、0.27% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O和0.015%维生素B1;菌丝摇瓶液体培养环境条件为pH 6.0，装液量300.0 mL（500.0 mL三角瓶）、温度26 ℃、转速140 r/min。【本研究切入点】目前，关于利用发酵罐培养技术培养黑皮鸡枞液体菌种的研究尚无文献报道。【拟解决的关键问题】优化黑皮鸡枞液体菌种发酵罐培养条件，以获得可用于大规模栽培黑皮鸡枞的液体菌种，为提高黑皮鸡枞菌的产量和品质提供参考依据。
　　1 材料与方法
　　1. 1 试验材料
　　黑皮鸡枞菌株015由湖南农业大学提供，黑皮鸡枞菌株018由湖南省食用菌研究所提供，黑皮鸡枞菌株016由湖南省微生物研究院提供。
　　1. 2 试验方法
　　1. 2. 1 斜面菌种制备 将菌种接于斜面培养基上，25 ℃恒温培养7 d，作为下一步摇瓶培养的菌种。
　　1. 2. 2 摇瓶菌种制备 于500 mL三角瓶中装入250.0 mL培养基，在121 ℃、0.12 MPa压力下灭菌30 min。冷却后每瓶接入3块1.0 cm2经活化的斜面菌种，25 ℃、90 r/min摇床培养5 d，得到液体菌种。
　　1. 2. 3 液体培养基C源、N源及其添加量比（C/N）优化 基础培养基为3.0 g K2HPO4+1.0 g MgSO4+2片维生素B1+1000.0 mL蒸馏水，pH 6.5。C源优化：在基础培养基中添加4.0 g高粱粉为N源，再分别添加20.0 g葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖为C源。采用15 L发酵罐，装液量12 L，接种量12%，转速90 r/min，罐压0.3 MPa，通气量0.9 m3/h，于25 ℃培养100 h后取样观察菌丝长势，测定菌丝生长速度。N源优化：在基础培养基中添加20.0 g葡萄糖为C源，再分别添加4.0 g黄豆粉、玉米粉、大米粉、高粱粉为N源。采用15 L发酵罐，装液量12 L，接种量12%，转速90 r/min，罐压0.3 MPa，通气量0.9 m3/h，于25 ℃培养100 h后取样观察菌丝长势，测定菌丝生长速度。
　　通过C源和N源的单因子试验（表1），筛选出黑皮鸡枞菌种摇瓶培养最适的C源和N源。采用均匀试验设计，在单因素试验基础上进行C源、N源和C/N优化试验。其因素及水平设计见表2。
　　1. 2. 4 发酵工艺优化 在最佳培养基的基础上，对发酵罐培养的接种量、装液量、培养温度、培养时间进行优化，以获得黑皮鸡枞液体菌种发酵罐发酵工艺。
　　采用15 L发酵罐，分别设10、11和12 L 3种装液量，10%、12%和15% 3种接种量，20、25和30 ℃ 3种培养温度和80、100和120 h 3种培养时间。将装有培养基的发酵罐于121 ℃灭菌30 min，冷却后接入摇瓶培养的种子液，加入消泡剂大豆植物油，在转速90 r/min、罐压0.2 MPa、通气量0.9 m3/h条件下培养，获得液体菌种。发酵结束后取样，通过显微镜观察菌液杂菌污染情况、菌丝体形态特征和结构特点及菌液颜色，测定菌丝球直径、菌丝体干重及菌液纤维素酶、漆酶和多酚氧化酶活性。 　　孙月娥，张俊韬，王卫东. 2011. 金针菇中多酚氧化酶活性测定及其护色研究[J]. 食品工业，（11）：68-70. [Sun Y E，Zhang J T，Wang W D. 2011. PPO activity determination and antibrowning measurement for Flammulina velutipes[J]. Food Industry，（11）：68-70.]
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