正造和反季节龙眼花芽分化过程中内源激素水平的变化

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　　摘要 研究了正造及反季节龙眼树体叶片及顶芽中内源激素IAA、GA、ABA、iPA、ZR在花芽分化过程中的变化。结果表明，花芽分化过程中叶片及顶芽ABA含量最高，IAA次之，ZR、iPA及GA含量极低。氯酸钾处理可导致叶片及顶芽iPA含量迅速升高；叶片GA含量远高于顶芽，而ABA以顶芽中富集量最大；ZR以顶芽含量较高；虽然IAA在叶片和顶芽都有较高水平，但变化幅度不大。综合各激素变化情况认为，花芽分化过程中iPA、GA、ABA含量变化幅度最大，且ABA在花芽分化的发生部位顶芽富集说明ABA在龙眼花芽分化过程中起更重要的作用。
　　关键词 龙眼；内源激素；花芽分化
　　中图分类号 S667.2 文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2019）09-0047-04
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.015
　　Abstract The endogenous hormone levels of IAA， GA， ABA， iPA， ZR and their changes were investigated in leaves and buds of six longan （Dimocarpus longan Lour.） trees for onseason and offseason flowering development after winter shoot mature. The result showed that the hormones contents of different types were different in vegetative organs， presented a decreasing tendency from ABA to IAA and ZR to iPA and GA. Potassium chlorate treatment could cause iPA content rapidly increase in leaves and buds. GA content in leaves were significantly higher than those of the buds， but the largest ABA content was found in the bud. And high levels of ZR were in the buds. Although IAA had a higher level in leaves and buds， the change magnitude was small. The hormone changes had concluded that， iPA， GA， ABA content changed greatly in the flower bud differentiation process， and ABA was enrichment in buds， the parts of flower bud differentiation occurred， indicating that ABA played a more important role in the process of flower bud differentiation of longan.
　　Key words Longan；Endogenous hormone；Flower bud differentiation
　　花芽分化是果树产量形成的第一步。成花机理的探索一直是果树学界最热门的课题之一。正常情况下龙眼经冬季低温诱导成花，龙眼可由氯酸钾诱导反季节成花，并形成产量，这使得经典的花芽分化理论面临新的挑战。顶芽分化为叶芽或花芽的时期也是不同激素含量及其动态平衡控制花芽分化的重要时期。因此，植物激素及其平衡在花芽分化中的作用显得尤为重要。随着植物激素对植物发育调控的研究不断深入，人们从激素的角度探索了果树成花的调控机理。激素所调控的成花信息的改变是由叶片产生并运输到生长点，它激活了所谓的“开花基因”控制。Bangerth[1]认为果树从营养芽转向花芽发育是一个不可逆的过程，需要植物激素瞬时变化来调控花芽的发端，但在龙眼、荔枝和柑橘的研究中发现在严苛条件下花芽均可逆转为叶芽，这使得传统的激素调控成花的理论受到了挑战，预示着更为复杂的激素变化在成花中的未知作用。
　　生长素在成花中的作用存在争议，在一些试验中IAA可以抑制花芽的形成，只要顶端供应的IAA减少可以提高花芽形成[2]，但在草莓中的研究发现阻断顶芽中IAA传输会延迟开花[3]。一般认为GA可抑制果树花芽分化，因此，在生产上应用PP333、C.C.C.（矮壮素）和Daminozide等来抑制枝梢中吲哚乙酸或赤霉素的生成及转运，并允许细胞分裂素和其他产物的积累，以促進花芽分化[4]。降低菊花红光与远红光比例导致腋芽中脱落酸（ABA）积累的升高，从而将更多的蔗糖驱向底部芽，ABA、SL和IAA均参与花芽调节过程[5]。对55个龙眼WRKY基因鉴定表明18个DlWRKY基因在“四季蜜”花诱导的3个阶段显示出特异性表达，可能是应激或激素反应基因[6]。柠檬花诱导过程中观察到更高水平的ABA，通过RNA测序鉴定总共1 638个差异表达的基因（DEG），确定DEG与开花、激素生物合成或代谢有关[7]。苹果分化芽的转录组分析显示细胞分裂素（CK）、脱落酸（ABA）和赤霉酸途径的复杂激素调节网络参与诱导苹果花形成。CK在细胞形成和分化的调节中起关键作用，且影响开花相关基因的表达水平。同时，ABA信号通过参与糖介导的开花途径调节苹果花的诱导。此外，芽中糖和淀粉沉积水平的变化可受ABA含量和参与ABA信号转导途径的基因表达的影响[8]。研究显示生长素（IAA）和赤霉素（GA）水平的下降，脱落酸（ABA）和细胞分裂素（CTK）水平的升高有利于果树花芽分化，龙眼的成花也涉及这种激素环境[9]。Luckwill等[10]指出，细胞分裂素与赤霉素的平衡对苹果成花过程起控制作用，对芒果和荔枝等的研究结果支持了Luckwill等[10]的假说。但迄今很少有对正造及反季节龙眼在成花过程中的激素水平做比较的研究。KClO3是如何调节龙眼树体激素变化而诱导成花的机理尚不清楚，笔者比较了正造与反季节龙眼在花芽分化期各阶段中iPA、GA、ABA、ZR、IAA含量变化动态，及其与成花的关系，旨在为完善反季节龙眼成花机理提供理论依据。 　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　供试材料为国家热带果树品种改良中心5～6年生长势相近的‘储良’龙眼树。正造龙眼采样自末次冬梢老熟开始至侧花原基形成后10 d止，每10 d采样一次，共采样6次。反季节龙眼抽生3次新梢的枝梢停止生长时进行反季节催花（氯酸钾处理龙眼根际），采样自催花之日开始至侧花原基形成后7 d结束，每7 d采样一次，共采样6次。样品包含叶片和顶芽。所有样品均液氮速冻带回实验室备用。
　　1.2 方法
　　1.2.1 提取。
　　称取0.5 g新鲜植物材料，加2 mL提取液（80%甲醇，内含1 mmol/L BHT），在冰浴下研磨成勻浆，转入10 mL离心管，再用2 mL提取液将研钵内残留物转入离心管中，摇匀后放置在4 ℃冰箱中4 h，10 000 r/min离心15 min，收集上清液。沉淀中加1 mL提取液混匀，置4 ℃下1 h后离心，合并2次提取的上清液并记录体积。上清液过C18固相萃取柱后备用。
　　1.2.2 iPA、IAA、GA 纯化。
　　取200 μL提取液用氮气吹干，并用试剂盒提供的样品稀释液定容至200 μL。
　　1.2.3 ABA、ZR 纯化。
　　取2 mL提取液用氮气吹干，并用试剂盒提供的样品稀释液定容到200 μL。
　　1.2.4 激素含量的测定。
　　采用酶联免疫吸附法测定内源激素含量，ELISA试剂盒由中国农业大学提供，测定激素包含ZR、IAA、GA、ABA、iPA，所有测定均重复3次。
　　2 结果与分析
　　2.1 iPA含量变化
　　正造树叶片中iPA含量在花芽分化过程中逐渐上升，在侧花原基形成时上升至最高水平（32.22 ng/g），随后下降。与叶片相比，正造龙眼顶芽中的iPA含量较低，尤其在侧花原基形成前30 d顶芽iPA含量仅为0.93 ng/g，至侧花原基形成时顶芽iPA含量达到最高峰11.85 ng/g，是叶片iPA含量的36.77%（图1a）。催花之前反季节龙眼与正造龙眼iPA含量相近，但催花之后反季节龙眼iPA含量变化与正造有很大差别。反季节龙眼叶片和顶芽iPA含量在催花之后均显著升高，反季节龙眼叶片中iPA含量在催花之后7 d达到催花前的8.72倍；在侧花原基形成前14 d叶片中iPA含量下降至催花前水平。顶芽中iPA含量在催花后迅速上升，在侧花原基形成前7 d达到峰值（12895 ng/g）（图1b）。
　　iPA具有促进细胞分裂、地上部分化、侧芽生长、叶片扩大及延缓叶片衰老等功能[11-15]。反季节龙眼由于打破了树体原有的激素平衡而诱导成花，而顶芽中iPA的迅速累积并在侧花原基形成时迅速消失或转移，暗示了反季节龙眼侧花原基分化对iPA的需求显著高于正造。
　　2.2 GA含量变化
　　检测了正造及反季节龙眼叶片和顶芽GA含量变化，并比较了花芽分化过程中叶片顶芽GA变化的差异。结果表明，无论是正造还是反季节龙眼，叶片和顶芽GA含量差别极大，尤以正造龙眼更显著。在侧花原基形成之前叶片GA含量持续上升，至冬梢老熟后20 d达32.77 ng/g，而在侧花原基形成时正造龙眼叶片GA水平降至低谷（11.07 ng/g）。正造龙眼顶芽中GA含量变化与叶片有相同趋势，但顶芽中GA含量极低，在冬梢老熟时仅为024 ng/g，在侧花原基形成之前20 d达到最高，仅为5.82 ng/g，至侧花原基完成时又下降至0.62 ng/g（图2a）。KClO3处理导致反季节龙眼叶片中GA含量出现应激性的上调，在催花后第7天达到峰值（39.78 ng/g），随后下降至7.77 ng/g，并于侧花原基形成前7 d达到第2个高峰19.26 ng/g，侧花原基形成时略有下降，随后与侧花原基形成前7 d相持平。顶芽中GA含量与正造顶芽中GA变化有相同趋势，在侧花原基形成之前7 d上升最高值（26.40 ng/g），随后下降。但反季节龙眼顶芽峰值比正造顶芽GA含量峰值高3.54倍（图2b）。
　　GA的主要功能是打破休眠，其在顶芽向花芽转变的过程中起着重要作用，而冬梢成熟时和夏梢抽生3次时，GA在顶芽中含量均下降，在侧花原基形成之前均呈上升趋势。这说明GA作为一种打破休眠的重要激素，其在龙眼营养生长向生殖生长转变过程中起重要作用。
　　2.3 ABA含量变化
　　正造龙眼叶片和顶芽ABA含量在花芽分化前后有较大变化，其中叶片在花芽分化过程中持续平稳上升，由初期的2.38 μg/g上升至侧花原基形成后10 d时的14.87 μg/g。顶芽中ABA含量变化最大，初期顶芽中ABA含量较低，仅为叶片的2.09倍，但随着花芽分化进程的推进，顶芽中ABA含量急速上升，仅在10 d后上升至21.04 μg/g，是初期时的4.23倍，随后持续上升，在侧花原基形成前10 d达到顶峰（30.42 μg/g），在侧花原基形成时又迅速下降至11.69 μg/g（图3a）。
　　反季节龙眼在催花之后叶片ABA含量变化幅度不大。侧花原基形成之前叶片中ABA含量为6.4～8.6 μg/g，在侧花原基形成时迅速下降至4.54 μg/g，并在侧花原基形成后7 d又迅速上升。较叶片而言，反季节龙眼顶芽在整个花芽分化过程中有极高的ABA含量，在初期的14 d 呈缓慢上升趋势，最高值达24.93 μg/g，随后转为缓慢下降趋势，侧花原基形成后7 d下降至11.89 μg/g（图3b）。
　　低温胁迫是诱导正造龙眼成花的必要条件；同时强氧化剂KClO3所诱导的反季节龙眼成花归根到底也是由于氧化胁迫所致。胁迫环境会导致ABA的积累，而ABA在植物中充当了传递环境胁迫信号的第一信使[16-18]。在末次梢老熟时，正造与反季节龙眼顶芽均有较高的ABA含量，这说明顶芽是胁迫信号的感应部位，在成花过程中具有重要的胁迫感应作用。 　　2.4 IAA含量變化
　　正造树在花芽分化过程中叶片和顶芽IAA含量变化不大。尤其在初期的20 d，叶片及顶芽IAA含量相近，均在2.0～2.4 μg/g，随后30 d内叶片IAA含量继续维持在2.0～2.5 μg/g，而顶芽出现较大变化，在侧花原基形成前10 d下降至1.75 μg/g，在侧花原基形成时又上升至288 μg/g；在侧花原基形成后10 d又下降至初期水平，降至211 μg/g（图4a）。在整个花芽分化过程中，反季节龙眼叶片IAA含量在1.7～2.6 μg/g；而顶芽IAA含量呈“V”字形变化，初期顶芽IAA含量为2.50 μg/g，至侧花原基形成前14 d下降至1.86 μg/g，之后开始回升，至侧花原基形成时顶芽中IAA含量升至最高水平，达2.62 μg/g（图4b）。
　　生长素抑制矮牵牛成花的作用通过其对乙烯合成的刺激作用来实现[2]，但研究表明生长素有促进成花的作用[19-20]。在草莓整个花芽分化过程中，顶芽有IAA大量富集；IAA是对成花诱导的有效促进剂，且顶芽生长点可能是主要作用的部位，阻断生长素在草莓顶芽中的积累可以延缓花芽分化的进程，并诱发异常花的发育[20]；由此可见IAA在成花中的作用还存在争议。该研究发现在正造及反季节龙眼侧花原基形成时，顶芽中IAA含量均达到最大值。因此认为IAA可能具有促进龙眼成花的作用。
　　2.5 ZR含量变化
　　龙眼叶片和顶芽ZR含量与IAA和ABA水平相比较低。正造龙眼叶片和顶芽ZR含量均在152 ng/g以下，且以顶芽ZR含量高。冬梢老熟时叶片中ZR含量仅为40.56 ng/g，花芽分化过程中叶片ZR含量逐渐上升，至侧花原基形成前20 d上升至87.15 ng/g，并在侧花原基形成时达到最高水平（113.35 ng/g）。顶芽初期ZR含量明显高于叶片，达137.24 ng/g，在侧花原基形成前30 d达到最高值（151.54 ng/g）（图5a）。反季节龙眼叶片和顶芽ZR含量高于正造龙眼，在催花初期尤为显著。催花初期14 d叶片中ZR含量变化不大，在70.88～73.00 ng/g，在侧花原基形成前7 d上升至99.74 ng/g，随后缓慢下降。顶芽在催花之前有较高的ZR含量，催花后顶芽中ZR含量持续下降，至侧花原基形成时降至93.96 ng/g（图5b）。
　　ZR作为一种具有生理活性的细胞分裂素，具有诱导出愈伤组织、不定芽生成及延缓叶片衰老等功能[21]，研究表明ZR含量的上升有利于果树成花[22]。KClO3处理打破了树体固有的激素平衡而诱导成花，顶芽中ZR含量并未迅速累积，暗示ZR可能在龙眼花芽分化中无促进作用。确切的结论还有待进一步验证。
　　3 结论与讨论
　　研究表明，KClO3可以在反季节龙眼处理后28 d内诱导侧花原基形成。尽管开花调控所涉及的机制尚不明确，研究显示KClO3诱导了龙眼叶和芽中内源激素（ABA、GA、IAA、iPA和ZR）水平的变化。KClO3处理后28 d，涉及花芽分化的重要激素发生显著变化。 已经发现KClO3处理导致花芽萌动，ABA、GA和iPA水平增加，并且与正造季节龙眼的激素水平相比，IAA和ZR水平降低。
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