橡子粉发酵柠檬酸

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　　摘要：橡子含较多单宁等涩味物质，导致其淀粉利用率低。本研究通过测定脱单宁、酶解及发酵过程中的关键指标，探究70%乙醇对单宁脱除效果的影响。采用数码生物显微镜及酸碱滴定法比较4种常见黑曲霉在发酵液中的形态及发酵产酸量。结果表明，70%乙醇脱单宁处理会显著促进橡子粉的液化和糖化作用，发液中黑曲霉的生物量和产酸量显著提高（P<0.05）;黑曲霉SIIMM288在33oC下的柠檬酸产量为37.30g/L，显著高于其他3株菌（P<0.05），该菌在发酵液中以菌丝球形态分布，菌丝无色透明、短而粗分支少、稀疏着生。说明，脱单宁处理会促进橡子粉的柠檬酸发酵，黑曲霉SIIMM288为橡子粉发酵柠檬酸的优势菌种，最佳发酵温度为33oC。
　　关键词：橡子粉;脱单宁;柠檬酸;发酵;黑曲霉
　　中图分类号：S789.7
　　文献标识码：A
　　文章编号：1000-4440（2019）02-0445-08
　　橡子是壳斗科栎属植物的种子[1]。中国有丰富的橡子资源，其种植面积达2.5x10°hm2，橡子年产量约1.0x107t，主要分布在云南、陕西、湖南和蒙古等地，其中陕西省橡子年产量约占全国的1/3，主要集中在秦巴山区[2-3]。橡子富含淀粉，经检测脱壳的橡子仁含淀粉达50.00%～70.00%、可溶性糖2.00%～8.00%、蛋白质1.17%～8.72%、单宁0.26%～17.74%、油脂1.04%～6.86%、粗纤维1.13%～5.89%、灰分1.30%～3.40%[4]。橡子虽然含有丰富的淀粉、蛋白质等营养物质，但其加工利用率却很低，原因是橡子中含有较多的单宁等抗营养因子，并有很强的涩味，导致直接食用或加工受到限制[5]。因橡子淀粉含量高，有些食品加工者将橡子提取的粗淀粉加工成凉粉、面条，也有被用作饲料的，但并不普及，利用率很低，绝大多数成熟后从树上坠落于地面腐烂，造成资源的大量浪费。
　　柠檬酸作为一种最常用的添加剂，广泛应用于食品、医药、化妆品、化工等领域[6-8]，其产量和消费量仅次于酒精，为世界上第二大发酵产品，且全球市场需求量以平均每年5%的速度增长[9]。工业上主要采用发酵法制备柠檬酸，常用的微生物有酵母和黑曲霉。酵母发酵过程中会产生较多的异柠檬酸，造成后续柠檬酸分离纯化困难;而黑曲霉具有酶系丰富，发酵效率高、副产物少等优势，因此柠檬酸工业上多采用黑曲霉为发酵菌种[10-11]。工业上用于柠檬酸发酵的糖质原料中，相比精制糖，淀粉质原料因其经济性更具有竞争力。随着柠檬酸需求量的增加，市场竞争压力增大，寻找新型廉价的柠檬酸发酵原料是目前国际上普遍关注和研究的问题之一。
　　本研究以橡子为发酵原料，结合柠檬酸工业化生产工艺，主要研究橡子粉单宁脱除、橡子淀粉液化糖化、菌种筛选及发酵条件等关键技术参数和工艺过程。这对提高橡子资源利用率和改进柠檬酸发酵技术有很好的指导意义。
　　 1 材料与方法
　　 1.1 材料与仪器
　　 1.1.1 主要试剂-淀粉酶、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）由北京奥博星生物技术有限责任公司生产，糖化酶由江苏常州凯乔生物化学有限公司生产，无水乙醇、酒石酸钾钠、正丁醇、醋酸、溴酚蓝等均为分析纯。
　　 1.1.2 发酵菌种黑曲霉SIIM M288（Aspergillus ni-ger SIIM M288）购自，上海市工業微生物研究所，黑曲霉CICC 2716（Aspergillus niger CICC 2716）和黑曲霉CICC 2160（Aspergillus niger CICC 2160）来自中国工业微生物菌种保藏管理中心，黑曲霉QL-1（Asperillusniger QL-1）由齐鲁大学微生物实验室保存。
　　 1.1.3 主要仪器可见分光光度计（722型）购自上海光谱仪器有限公司，台式恒温振荡器购自上海跃进医疗器械有限公司，扫描电子显微镜（S-3400N）购自日本日立公司，数码生物显微镜ME21（MS-HOT）]购自奥林巴斯公司。
　　 1.2 试验方法
　　 1.2.1 橡子粉的制备及预处理成熟橡子采自秦岭西麓，自然晒干，去壳后粉碎备用。参照文献[12]选择70%乙醇水溶液进行脱单宁处理，按粉质量和乙醇液体积比1：5加入，磁力搅拌作用下进行单宁脱除，脱单宁后的橡子粉在1000 r/min转速下离心10 min，除去上清液，自然晾干后备用。
　　 1.2.2 菌种活化与孢子悬液的制备将保藏菌种接种到PDA斜面培养基，在霉菌培养箱28oC活化5d，然后转接于PDA平板固体培养基中，相同温度条件下培养6～7d，用适量无菌水将孢子洗下，振荡，制成均匀的孢子悬液，孢子数达每1 ml 9.60x107～1.33x108个。
　　 1.2.3 橡子粉的糊化和液化对不同脱单宁时间（0 min、30 min、60 min、90 min、120 min）的橡子淀粉进行糊化及液化。橡子粉与水按质量比1：5进行混合，在95oC加热糊化30 min，冷却至60oC，用氢氧化钙调节pH至6.0～6.5，按37U/g加入-淀粉酶，酶解淀粉，用碘化钾试剂检测液化液的颜色，测定液化终了时的糖含量。
　　 1.2.4 橡子粉的糖化将橡子粉液化液用6 mol/L盐酸调节pH至4.2～4.5，调整温度至60oC，按250U/g加入糖化酶，在搅动状态下保温糖化10h，间隔一定时间测定糖化液的糖含量。
　　 1.2.5 柠檬酸发酵取橡子酶解液于250 ml三角瓶中，105oC下维持10 min进行杀菌，冷却后，接入1 ml孢子悬液，置于恒温振荡器中进行发酵培养，培养温度33oC，摇床转速200r/min，连续培养72h，每隔12h取样测定还原糖及柠檬酸含量。 　　 1.2.6 橡子粉糖化对柠檬酸发酵的影响取经过60 min脱单宁的橡子粉，糊化后，1份用-淀粉酶进行液化处理，另1份先经-淀粉酶水解，再用糖化酶进行糖化处理，将分别得到的液化液和糖化液接种1 ml孢子数达9.60x107～1.33x108个的黑曲霉SIIM M288菌悬液，其他发酵条件同方法1.2.5，进行橡子粉糖化对柠檬酸发酵影响的研究。
　　 1.3 测定方法
　　 1.3.1 单宁测定采用酒石酸亚铁法[13]，并稍作修改。标准曲线的制作：吸取0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml和1.0 ml单宁酸标准溶液（1 mg/ml）于10ml容量瓶中，用蒸馏水补至1.0 ml，加2.0 ml酒石酸亚铁溶液，用pH7.5磷酸盐缓冲液定容，于540nm处测吸光值，以单宁酸质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标制作标准曲线，并得回归方程（Y=10.4670x+0.0121，R2=0.997）。
　　 1.3.2 还原糖及总糖含量测定参照文献[14]。准确吸取0.25 ml 、0.50 ml、0.75 ml、1.00 ml、1.25ml和1.50 ml葡萄糖标准溶液（1 mg/ml）于试管中，用蒸馏水补至1.50 ml，加入1.50 ml DNS试剂和1.50 ml蒸馏水，沸水浴5 min，冷水冷却，定容至25.00ml，于550nm处测吸光值，以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标制作标准曲线，并得回归方程：Y=9.1919x+0.0034，R2=0.992。
　　还原糖和总糖含量测定参照文献[15]，并稍作修改。取10.0 ml发酵液，5000 r/ min离心10 min，取出上清液，DNS比色法测定还原糖含量。准确量取0.5 ml上清液，加入0.4 ml 浓硫酸，沸水浴5min，在冰水中迅速冷却，用40% NaOH中和，调节pH至7.0～9.0，定容至100.0 ml，采用DNS比色法测定总糖含量。
　　 1.3.3 柠檬酸测定和鉴定采用酸碱滴定法，用0.1429 mol/L氢氧化钠溶液进行滴定[16]，柠檬酸含量以发酵液中总酸计算。用纸层析色谱法进行柠檬酸的鉴定[17]。展开剂：正丁醇：醋酸：水=12：3：5（体积比）;显色剂：400mg溴酚蓝溶于1L体积分数为95%的乙醇，用NaOH调节pH值至7.5。
　　 1.3.4 生物量测定生物量的测定参照文献[18]。
　　 1.3.5 橡子淀粉的超微结构观察将不同脱单宁时间的橡子粉用扫描电子显微镜观测并拍摄颗粒形态。
　　 1.3.6 发酵液菌丝形态显微镜观察挑取橡子发酵液中的黑曲霉，用生物显微镜在放大倍数为400倍下直接进行形态观察。
　　 1.4 数据分析
　　试验数据运用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，结果以平均值x标准差（x+SD）的形式表示，采用LSD法检验组间差异显著性。
　　 2 结果与分析
　　 2.1 脱单宁对橡子粉液化的影响
　　用乙醇水溶液脱除橡子单宁，处理时间不同，单宁脱除量不同。脱单宁时间对橡子粉成分及液化影响结果见表1。随脱单宁时间的延长，单宁含量下降，同时蛋白质含量也在下降。脱除时间为60min，与对照相比，单宁含量降低了56.31%;脱单宁时间为120min，单宁含量下降了67.23%，蛋白质含量由29.31 mg/g降为24.31 mg/g。说明70%乙醇对橡子粉中单宁有良好的脱除效果，但同时橡子粉中蛋白质会有一定损失。
　　從表1可以看出，随单宁脱除量的增加，-淀粉酶完全液化橡子淀粉的时间缩短，液化液中的总糖和还原糖也有所变化，说明单宁对橡子淀粉的酶法液化有一定抑制作用。当脱除时间为60 min时，橡子粉中的单宁含量下降为5.64 mg/g，淀粉液化完全的时间缩短为40 min，总糖含量提高至99.02g/L，还原糖含量上升为63.77 g/L，其总糖含量显著高于原料（P<0.05），但和脱除时间为120 min的相比，总糖含量无明显差异（P>0.05），还原糖含量显著高于原料和脱单宁时间为120 min橡子粉（P<0.05）。说明橡子粉在液化时，较高的单宁含量会影响淀粉液化和还原糖的生成，当单宁含量减低到一定值时，不再成为液化的限制因素。因此，橡子粉发酵柠檬酸时脱单宁不必脱除彻底。
　　 2.2 脱单宁对橡子粉糖化的影响
　　在经不同时间脱单宁的橡子粉液化液中加入糖化酶，进行糖化处理，观察单宁对橡子粉糖化的影响，结果见图1。随糖化时间的延长，还原糖含量不断增加，6h后趋于稳定;当糖化时间相同时，经过不同时间脱单宁处理的橡子粉，糖化时还原糖含量也不尽相同，脱单宁时间超过60min，还原糖含量明显高于未处理和处理30 min的（P<0.05）。同时糖化6 h，脱单宁时间120 min的还原糖含量为92.42g/L，显著低于脱单宁时间60min和90 min的（P<0.05），其原因可能与脱单宁时淀粉中蛋白质变化有关[12]。
　　 2.3 脱单宁对橡子淀粉颗粒的影响
　　单宁会抑制橡子粉的酶解，但当其不再是限制因素时，随脱除时间的继续延长，反而酶解效率有所降低，这可能与橡子淀粉及蛋白质的变化有关。不同脱除时间橡子粉的形貌见图2，橡子淀粉颗粒主要是球形或卵形，这与Stevenson等[19]的报道一致，而其颗粒直径与报道的3～17 μm有一定差异，这可能与橡子品种有关。橡子淀粉被包裹在胶状物质中并通过其相互连接，该物质可能是蛋白质;经过脱单宁处理的橡子淀粉与胶状物质粘连程度不大，颗粒间的连接较疏松甚至分离，这在一定程度上使橡子粉更易被酶水解。
　　 2.4 脱单宁对黑曲霉生长的影响
　　单宁会与蛋白质及其他氮源结合，螯合金属离子，影响橡子粉发酵液中黑曲霉生长。在不同脱除时间的橡子粉液化液中接入黑曲霉孢子悬浮液，培养72h后的生物量见图3，脱除时间为60min的生物量是18.63 g/L，显著高于原料和脱除时间30min、120min的（P<0.05），Chao等[20]报道，当单宁质量浓度低于1 g/L时，单宁对菌体生长就会失去抑制作用。 　　 2.5 脱单宁对柠檬酸发酵的影响
　　图4结果显示，在0～12 h，黑曲霉孢子处于休眠调整和萌发并形成营养菌丝期，柠檬酸几乎没有积累。发酵液还原糖质量浓度在0～24 h有上升趋势，说明黑曲霉分泌的糖化酶将发酵液中一些高分子糖水解为还原糖;在24～60 h还原糖急剧下降，柠檬酸大量积累;当发酵时间超过60 h，柠檬酸质量浓度趋于稳定，可能由于此时发酵液中还原糖质量浓度过低。脱单宁时间601min的柠檬酸产量是37.85 g/L，显著高于原料和脱单宁时间30 min的（P<0.05），说明单宁会抑制柠檬酸积累。
　　 2.6 橡子粉发酵产物
　　在柠檬酸发酵过程中，由于乌头酸酶、a-酮戊二酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶的活性受到抑制，使得柠檬酸开始积累[21]，发酵液中除大量柠檬酸外，还有草酸、乌头酸等杂酸。用纸层析色谱对发酵液中的有机酸进行鉴别，结果见图5。黑曲霉SIIMM288发酵橡子粉液化液，产物主要为柠檬酸，其次还检出少量草酸，其他酸未检测到。
　　 2.7 橡子粉糖化对柠檬酸发酵的影响
　　由于黑曲霉可以分泌糖化酶，将发酵液中高分子糖水解为可发酵性糖，因此可以利用黑曲霉进行同步糖化发酵。试验结果发现，黑曲霉SIIM M288发酵橡子粉液化液的柠檬酸产量为37.85 g/L，而发酵糖化液的柠檬酸产量为39.62 g/L，这可能因为黑曲霉分泌的糖化酶不足或酶活性低。虽然橡子粉糖化液的柠檬酸产量略高于液化液，但糖化会大大增加时间及设备成本，因此在实际生产中不进行糖化处理，直接将黑曲霉接种于液化液中进行发酵。
　　 2.8 橡子粉发酵柠檬酸菌种的选择
　　黑曲霉菌种对橡子粉发酵有很大影响，不同菌株，其生长条件各异，产酸量也不尽相同。试验选用柠檬酸生产常用的4株菌，分别接种于橡子粉液化液中进行摇瓶培养，筛选最佳菌株。菌株在发酵液中的形态见图6，产酸量见图7。
　　由图6可见，黑曲霉SIIM M288在发酵液中以菌丝球形态分布，菌落呈不规则皱褶，中央隆起，菌丝无色透明，短而粗分支少、稀疏着生，这种形态的菌有利于产酸，且有研究报道，菌丝球直径越小，对产酸越有利[8，22];CICC 2716在发酵液中产生大量菌丝，分支较多，而CICC 2160和QL-1的菌丝远比CICC 2716致密，这对产酸极其不利，过密的菌丝会限制溶氧及营养与细胞之间的传输速率。黑曲霉CICC 2716发酵的产酸量显著高于CICC 2160和QL-1，同时显著低于SIIM M288（P<0.05）。结果表明菌丝稀疏、分支少、短而粗有利于产酸，而菌丝致密，对产酸极其不利。从图7可知，黑曲霉SIIMM288在33oC产酸量达37.30 g/L，显著高于其他菌株（P<0.05）。说明用橡子粉发酵柠檬酸时黑曲霉SIIM M288是优势菌种。
　　 2.9 黑曲霉SIIM M288发酵柠檬酸的温度
　　发酵温度是影响柠檬酸产生的关键因素之一，将黑曲霉SIIM M288接种于脱单宁时间为60min的橡子粉液化液中，结果见图8。黑曲霉SIIM M288在339C的产酸量为37.30g/L，显著高于其他发酵温度（P<0.05）。说明黑曲霉SIIM M288对发酵温度比较敏感，过高或过低均会较大程度地抑制柠檬酸的积累。
　　 3 讨论
　　 3.1 脱单宁对橡子粉液化、糖化及发酵的影响
　　橡子单宁含量丰富，其与蛋白质结合，抑制黑曲霉分泌糖化酶和其他与代谢有关的酶的生物活性[23]本研究结果表明，单宁会抑制橡子粉的酶解及黑曲霉产酸能力。当单宁不再是限制因素时，发酵液中其他营养物质的变化对橡子粉的酶解及发酵产酸量均有一定影响，这是由于处理时间过长会影响淀粉的平均分子质量，蛋白质的变化会影响淀粉凝胶的酶解能力[12，24];因为氮源与蛋白质、核酸、维生素等的合成密切相关，因此氮源不足会影响菌体生长，降低柠檬酸积累[25]
　　 3.2 糖化对橡子粉柠檬酸发酵的影响
　　在柠檬酸工业化生产中，原料采用精制糖能够获得较高产量，但生产成本高，相比而言，淀粉质原料更具有竞争力，但淀粉不能被直接利用，需经液化、糖化等工艺，才能获得可发酵性糖[26，27]。利用黑曲霉进行柠檬酸发酵，基于其自身的糖化能力，可以将液化处理的淀粉质原料进行同步糖化发酵[10-11]。本研究结果表明，橡子粉液化液中低分子量的糊精及寡糖，可以被黑曲霉分泌的糖化酶水解成可发酵性糖，因此可以边糖化边发酵。淀粉质原料同步糖化发酵的柠檬酸产量与淀粉质原料糖化后再发酵的柠檬酸产量无明显差异，还节省了时间及设备成本，因此在实际生产中可对淀粉质原料不进行糖化处理。
　　 3.3 柠檬酸产量及发酵中杂酸的产生
　　本研究结果表明，黑曲霉发酵柠檬酸的产酸量与菌种有密切联系，菌丝稀疏、分支少、短而粗有利于产酸，而过密的菌丝会限制溶氧以及营养与细胞之间的传输速率，对产酸极其不利，与Papagianni等[28]的研究结果一致。产酸量还受发酵液中营养成分及发酵条件的影响，因此需要对发酵液成分进行优化，同时还需控制温度、溶氧及初始pH值等培养条件，以期获得最高的柠檬酸产量[25，29-30]，本研究结果也表明温度会显著影响黑曲霉产酸。因此利用橡子粉进行柠檬酸发酵，后期还应对发酵液成分进行优化，补充对产酸有利的营养因素，还需要进一步研究温度、溶氧及初始pH值等培养条件对产酸的影响，以达到柠檬酸产量最大化，提高橡子资源利用率。
　　柠檬酸是三羧酸循环的中间代谢产物，在柠檬酸积累过程中，会产生一些杂酸。刘辰[16]报道诱变株A.niger Wml-016只产生草酸1个杂酸，与本研究結果一致。徐凯[31]报道含量最高的杂酸为草酸，还有一些其他杂酸，且随着温度的升高，杂酸含量有所上升，但上升幅度不大。代真真[32]通过HPLC检测出发酵液中有草酸、顺乌头酸及反乌头酸等杂酸，但杂酸的含量非常小。杂酸的存在一方面降低了转化率，另一方面对柠檬酸的提取工艺不利，因此在生产中应通过菌种的筛选或驯化及调控发酵条件来控制杂酸的产生。 　　过多单宁对橡子粉的酶解及发酵产酸均有抑制作用，当单宁不再是限制因素时，发酵液中的营养物质在一定程度上影响发酵产酸。由于黑曲霉在生长时会分泌糖化酶，可以同步糖化发酵柠檬酸。黑曲霉SIIMM288是橡子粉柠檬酸发酵的优势菌种，其在发酵液中以菌丝球形态分布，菌丝无色透明、短而粗、分支少、稀疏着生，发酵最佳温度为33oC，在发酵液中有少量草酸的产生。
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