扶正解毒口服液质量控制方法研究

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　　摘要：目的  建立扶正解毒口服液的质量控制方法。方法  采用TLC法对扶正解毒口服液中的板蓝根、黄芪和淫羊藿进行鉴别;采用HPLC法测定（R，S）-告依春的含量。结果  在薄层色谱鉴别中均能检出板蓝根、黄芪和淫羊藿的特征性斑点;以（R，S）-告依春对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，以峰面积（Y，μv）对浓度（X，μg/ml）进行线性回归，绘制标准曲线，其回归方程为：Y=45784.94X-17640.25，相关系数r=0.99997，试验结果表明：（R，S）-告依春浓度在4.63～123.38 μg/ml，呈良好的线性关系。标准中建立的（R，S）-告依春的含量测定方法耐受性良好、灵敏度高、重现性好、专属性强，可以有效控制产品的质量。结论本方法能准确、可靠的对扶正解毒口服液中（R，S）-告依春含量进行测定，可作为该制剂的质量控制方法。
　　关键词：扶正解毒口服液;薄层鉴别;含量测定
　　中图分类号：R286.0                                 文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.07.029
　　文章编号：1006-1959（2019）07-0100-04
　　Abstract：Objective  To establish a quality control method for Fuzheng Jiedu Oral Liquid. Methods  TLC method was used to identify Radix Isatidis， Astragalus and Epimedium in Fuzheng Jiedu Oral Liquid. The content of （R， S）-Gu Yichun was determined by HPLC. Results  The characteristic spots of Radix Isatidis， Astragalus and Epimedium were detected in the identification of TLC; the concentration of （R， S）-Guyuechun reference was taken as the abscissa， the peak area was the ordinate， and the peak area was（Y， μv） linear regression of concentration （X， μg / ml）， draw a standard curve， the regression equation is： Y=45784.94X-17640.25， correlation coefficient r=0.99997， the test results show：（R， S） - The concentration of spring was in the range of 4.63～123.38 μg/ml， showing a good linear relationship. The method for determining the content of （R， S）-Yueyichun established in the standard is well tolerated， sensitive， reproducible and specific， which can effectively control the quality of the product.Conclusion  The TLC method can accurately and reliably determine the content of （R，S）-Gu Yichun in Fuzheng Jiedu Oral Liquid， which can be used as the quality control method of the preparation.
　　Key words：Fuzheng Jiedu oral liquid;Thin layer identification;Content determination
　　扶正解毒口服液由板藍根、淫羊藿和黄芪组成，功能扶正祛邪，清热解毒[1]。用于治疗鸡传染性法氏囊病[2]。传统中药散剂在禽病防治中常采用常规方式粉碎混匀给药，由于鸡的肠道较短，药物在消化道的通过时间与家畜相比非常短，对纤维素的消化能力低，消化液中的消化酶只能将药物中的很少一部分有效成分浸出，药物的吸收利用率低，单位体重用量大，见效慢，同时仍大部分的药材随粪便而排出造成很大浪费。目前，提高中药材的生物利用度已成为竞相研究的热点，而超微粉、提取粉、口服液的生物利用度理论上均高于散剂，经过对比几种剂型的优劣势，选择将扶正解毒散经研究改变剂型为口服液，既提高药物的生物利用度，又节约了成本。本文将扶正解毒散经研究改变剂型，开发为新兽药扶正解毒口服液，原剂型产品质量标准较简单只有显微鉴别，没有薄层和含量测定项。为了控制产品质量，笔者建立了扶正解毒口服液的质量控制方法。定性方面建立了黄芪、板蓝根、淫羊藿的薄层色谱鉴别;含量方面建立了板蓝根中的（R，S）-告依春含量测定，可作为该制剂的质量控制方法。 　　1材料与方法
　　1.1仪器与试药  Agilent Technologies-1260型高效液相色谱仪，紫外可变波长检测器，安捷伦色谱数据工作站;薄层色谱数码相机成像系统GoodSee-20E，上海科哲生化科技有限公司。扶正解毒口服液，由河南牧翔动物药业有限公司提供，批号：20170101、20170102、20170103。（R，S）-告依春对照品，含量100.0%，批号111753-20706;淫羊藿苷对照品，含量94.2%，批号110737-201516;以上均购自中国食品药品检定研究院。黄芪甲苷对照品，含量100.0%，批号110781-201717;购自中国药品生物制品检定所。硅胶G板、H板、GF254板;双蒸馏水;甲醇、乙腈为色谱纯;其他试剂均为分析纯。
　　1.2方法
　　1.2.1薄层鉴别  ①板蓝根的薄层色谱鉴别：取本品10 ml，加水20 ml，超声处理30 min，濾过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 ml使溶解，作为供试品溶液。取（R，S）-告依春对照品，加甲醇制成每1 ml含0.2 mg的溶液，作为对照品溶液[3]。另按照本处方药材比例与制法，制备缺板蓝根阴性溶液。吸取上述三种溶液各10 μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置波长254 nm紫外光灯下检视[4]。②淫羊藿的薄层色谱鉴别：取本品30 ml，用乙醚振摇提取2次，30 ml/次，弃去乙醚液，用乙酸乙酯振摇提取2次，30 ml/次，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇 2 ml使溶解，作为供试品溶液[5]。取淫羊藿苷对照品，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。另按照本处方药材比例与制法，制备缺淫羊藿的阴性溶液。吸取上述三种溶液各5 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10：1：1：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，在105℃ 加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视[6]。③黄芪的薄层色谱鉴别：取本品20 ml，用水饱和正丁醇振摇提取3次，30 ml/次，合并正丁醇液，用4%氢氧化钠溶液洗涤3次，30 ml/次，弃去碱液，再用水洗涤3次，30 ml/次，弃去水液，分取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2 ml使溶解，加入中性氧化铝（100～120目）2 g拌匀，蒸干，用40%甲醇50 ml分次搅拌洗涤，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液[7]。另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg 的溶液，作为对照品溶液。另按照本处方药材比例与制法，制备缺黄芪的阴性对照溶液。吸取上述三种溶液各2 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水（13：7：2）10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃ 加热至斑点显色清晰。
　　1.2.2板蓝根中（R，S）-告依春含量测定  ①色谱条件：以 Hypersil ODS2 C18色谱柱（4.6×250 mm，5 μm）;流动相为甲醇-0.02%磷酸溶液（7：93），流速1.0 ml/min，检测波长254。理论板数按（R，S）-告依春峰计算应不得低于5000。采用此色谱条件，流出的曲线基线稳定、分离度高，重复性好，因此本品采用此色谱条件[8]进行含量测定。②对照品溶液的制备：取（R，S）-告依春对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含40 μg的溶液，即得。③供试品溶液的制备：取扶正解毒口服液批号为20170101，精密量取5 ml，各四份，分别置于25 ml量瓶中。第1#供试品不超声，第2#、3#、4#供试品加水适量，分别超声处理10、20、30 min，放置室温，加水定容至刻度，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液，作为供试品溶液。④专属性试验：依据处方中的比例，按制法制备缺板蓝根阴性对照溶液，在选定的色谱条件下，同时取对照品溶液、供试品溶液、缺板蓝根的阴性对照溶液进样。⑤线性关系试验：精密称取（R，S）-告依春对照品7.75 mg置25 ml容量瓶中，加甲醇溶解，分别制成浓度为4.63、9.25、18.51、37.01、61.69、123.38 μg/ml，进样10 μl，测定峰面积。⑥精密度试验：取同一浓度（R，S）-告依春对照品溶液，进样量10 μl，分别连续进样6次。⑦重复性试验：取同一批供试品（批号：20170101），按供试品溶液制备方法，制备6份样品，在选定的色谱条件下，测定峰面积并计算含量。⑧稳定性试验：取供试品（批号：20170101），按照供试品溶液制备方法配制溶液，在选定的色谱条件下，分别于0、2、4、8、12 h测定，测定峰面积并计算含量。⑨加样回收率试验：采用加样回收法测定。精密称取（R，S）-告依春对照品5.31 mg，置10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照储备液。精密量取供试品溶液（批号为20170101，含量为114.4 μg/ml）6份，每份精密量取5 ml，置25 ml量瓶中，依次对应加入对照储备液1 ml，加水定容至刻度，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，弃取初滤液，收集续滤液，即得供试品溶液，精密吸取对照品溶液和供试液各10 μl分别注入液相色谱仪测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。⑩（R，S）-告依春含量限度测定：取连续批次生产的扶正解毒口服液10批，按供试品溶液制备方法处理，取10 μl进样，记录峰面积并计算含量。
　　2结果
　　2.1板蓝根的薄层色谱鉴别  结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品色谱在相应的位置上无干扰，表明该方法专属性强，薄层图谱见图1。
　　2.2淫羊藿的薄层色谱鉴别  结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的荧光斑点，阴性样品色谱在相应的位置上无干扰，表明该方法专属性强，薄层图谱见图2。 　　2.3黄芪的薄层色谱鉴别  结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点;置紫外光灯（365 nm）下检视，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照样品在相应的位置上无干扰。表明该方法专属性强，薄层图谱见图3、图4。
　　2.4板蓝根中（R，S）-告依春含量测定
　　2.4.1供试品溶液的制备  在选定的色谱条件下，精密量取供试品溶液和对照品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定结果为不超声、超声10、20和30 min，含量分别为115.8、115.5、115.3和115.9 μg/ml。结果表明样品超声与不超声提取差别不大，因此，选用不超声。
　　2.4.2专属性试验  供试品溶液色谱与对照品溶液色谱在相同的保留时间内有（R，S）-告依春色谱峰，而阴性對照溶液无此峰，说明扶正解毒口服液的其它成分对（R，S）-告依春的测定无干扰。
　　2.4.3线性关系试验  标准曲线回归方程为：Y=45784.94X-17640.25，相关系数r=0.99997，（R，S）-告依春浓度在4.63～123.38 μg/ml内呈良好的线性关系。
　　2.4.4精密度试验  测定记录（R，S）-告依春峰面积，平均峰面积为1707201.88，其RSD为0.3%，仪器精密度良好。
　　2.4.5重复性试验  平均含量为114.4μg/ml，RSD为0.2%，重复性良好。
　　2.4.6稳定性试验  平均含量为113.5μg/ml，RSD为0.4%，供试品溶液中（R，S）-告依春在12 h内保持稳定。
　　2.4.7加样回收率试验  平均加样回收率为99.7%，RSD为0.3%，具有良好的回收率，见表1。
　　2.2.8 （R，S）-告依春含量限度测定  按选定的色谱条件，测定10批中试产品平均含量为115.6 μg/ml，以降低20%限度计，含量限度定为本品中每1 ml含板蓝根按（R，S）-告依春（C21H18O11）计，不得少于90.0 μg/ml。
　　3讨论
　　扶正解毒口服液的成分复杂，为了在生产中能保证药品质量，选择用薄层色谱法对板蓝根、黄芪和淫羊藿进行定性鉴别，能清晰的看到板蓝根、黄芪和淫羊藿的特征性斑点。研究表明，板蓝根含有多种化学成分，并具有抗病毒药理活性，抗病毒主要代表性物质基础为（R，S）-告依春[4]。含量测定采用高效液相色谱法测定扶正解毒口服液中（R，S）-告依春的含量，具有重要意义，该方法简便、快速、准确，可以应用于生产中的质量控制。
　　板蓝根中化学成分复杂，主要含（R，S）-告依春以及多种氨基酸等。以精氨酸为考察指标，供试品处理后，斑点分不开，还不在同一位置，原因可能是多糖类成分有干扰;精氨酸专属性不强，山药和苹果皮等都含有。因按药典板蓝根药材供试品溶液的制备方法制的供试品溶液，点样困难，展开后，斑点不清晰，会造成假阴性，因此修订优化该方法，选择水做溶剂提取，有效成分提取充分，易点样，供试品中（R，S）-告依春的斑点清析，阴性无干扰。淫羊藿含有黄酮类化合物、木脂素、生物碱、挥发油等。考察不加乙醚前处理，斑点不清晰，分离度差。增加了乙醚前处理，使药液脱脂，采用TLC法，分离效果好，斑点清晰，重现性好，收入标准。黄芪含有黄酮类、多糖类、皂苷类成分。处理过程先用水饱和正丁醇萃取，碱液洗涤，再水洗，正丁醇液蒸干，甲醇溶解，过中性氧化铝柱，洗脱，供试品经过处理后，采用TLC法，分离效果好，斑点清晰，重现性好，收入标准。按选定的色谱条件，测定10批中试产品（R，S）-告依春平均含量为115.6 μg/ml，以降低20%限度计，含量限度定为本品中每1ml含板蓝根按（R，S）-告依春（C21H18O11）计，不得少于90 μg/ml。
　　参考文献：
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　　[7]吴炜，张培影，陈永刚.黄芪保心合剂质量标准研究[J].医药导报，2018（3）：341-342.
　　[8]巩伟，孙旭，赵庆华，等.HPLC法测定双根口服液中（R，S）-告依春的含量[J].解放军药学学报，2014，30（2）：167.
　　收稿日期：2018-12-21;修回日期：2019-1-15
　　编辑/成森
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