蛹虫草虫草素研究进展

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　　摘 要：虫草素是蛹虫草中重要的生物活性之一，具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、提高免疫力等生物功效，目前主要从蛹虫草相关培养物中提取虫草素。从虫草素的药理作用、提取、分离纯化、测定以及优化虫草素的产量方面进行综述，总结蛹虫草虫草素研究进展，并进行相关展望。
　　关键词：蛹虫草;虫草素;药理作用;提取纯化;产量
　　DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.02.019
　　Abstract： Cordycepin is one of the important biological activities in cordyceps militaris， with the biological effects of antitumor， antiinflammation， antibacterial， antivirus and improving immunity. At present， cordycepin is mainly extracted from cordyceps militarisrelated cultures. In this paper， the pharmacological effects， extraction， separation， purification， determination and optimization of cordycepin production were reviewed. The research progress of cordycepin was summarized and the related prospects were prospected.
　　Key words： Cordyceps militaris; Cordycepin; Pharmacological effect; Extraction and purification; Yield
　　虫草素Cordycepin又称冬虫夏草素、虫草菌素、蛹虫草菌素，是一种腺苷类物质。别称3′脱氧腺苷（3′deoxyadenosine），分子量为251 D，分子式组成为C10H13N5O3 ，紫外光的最大吸收波长为259 nm[1-2]。虫草素最早是在蛹虫草的培养滤液中发现并定名[3]。虫草素既可以溶于水也可以溶于甲醇和热乙醇，但不溶于苯、乙醚、氯仿[4]。虫草素作为研究对象一直以来受到国内外学者的极高关注。本文对虫草素的相关研究进展进行综述。
　　1 虫草素的药理作用
　　1.1 抗肿瘤作用
　　虫草素作为虫草的主要生物活性之一，大量的试验研究证实，虫草素具有抗肿瘤作用，其对人的白血病细胞、肝癌细胞、人鼻咽癌KB细胞、宫颈癌HeLa细胞、肉瘤S180、Lewis肺癌、鼠的B16BL6黑素瘤细胞等均能产生明显的抑制作用[5-11]。因此，虫草素可作为抗肿瘤药物的一种开发方向，且虫草具有较高的天然安全性。
　　1.2 免疫调节作用
　　近些年有很多试验研究证实，虫草素具有免疫调节功能。有研究指出，虫草素能显著提高人外周血单核细胞IL10的分泌，同时会抑制IL2的分泌，表明其具有免疫调节作用[12]。此外也有报道虫草素可以促进T淋巴细胞转化[13]。
　　1.3 抗菌、抗病毒作用
　　虫草素作为核苷类物质，对细菌、真菌、病毒等微生物的代谢有多重作用。有人研究了虫草素对侵入型念珠菌具有抗真菌活性[14]。此外有大量的报道表明，虫草素对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、炭疽杆菌等[15-16]均有抑制作用;对白血病病毒宿主细胞转化有抑制作用;对人类疱疹病毒、脑膜炎病毒、HIV1型病毒等亦有杀伤抑制作用[17-18]。虫草素作为一种广谱抗生素引起国内外研究者的高度重视。
　　1.4 其他作用
　　有部分研究指出，虫草素具有抗炎癥作用。有研究表明，虫草素从某些方面可以干扰炎症发生机制，从而抑制炎症反应[19-20]。另外，虫草素还具有溶血栓[21]的功效，调节血管壁[22]、抑制血小板凝集[23];虫草素对布鲁锥虫有治疗效果[24]。
　　2 虫草素提取方法
　　当前虫草素获取的途径主要有2种：一种是生物合成途径，是由蛹虫草相关培养中提取，包括子实体、菌丝体及发酵液;二是人工化学方法合成。对于虫草素人工化学合成技术，国内外早有相关研究报道，但合成过程复杂，可重复操作性困难，原料、设备投入成本高、产率低[25]，且在合成过程中用到的大量有机溶剂会对环境造成不良影响，工业化生产难以实现。
　　虫草素提取方法主要有浸提法、渗漉法、超声法、索氏提取法、回流法及超临界萃取等。凌建亚等[26]比较其中4种方法对虫草素提取的影响。结果表明：浸提法耗时长且提取效果一般，不利于下一步试验进行。而分别调整回流提取、索氏提取及超声法提取的作用时间均得到相近结果。但采取超声法提取更快捷、简便，受外界干扰小，同时可减少回流前后称重、补足溶剂定容所带来的误差。
　　陈伟等[27]分别利用水、乙醇、甲醇作为提取剂提取蛹虫草子实体干粉中的虫草素，对比发现蒸馏水是最佳溶剂。常见的把超声、微波、酶法等作为辅助提取手段。张嘉等[28]利用水热回流法、醇热回流法、超声水提法、超声波醇提法进行试验，研究表明超声波醇提法提取率最高，确定的最佳提取工艺为75%乙醇超声波提取3次、每次40 min、料液比1∶20。夏敏等[29]利用微波法提取虫草素并用HPLC法测定其含量，微波法提取的最佳工艺为提取液10 mL、料液比1∶200、中火处理3 min，样品中虫草素测量值达12.16 mg·g-1，且比超声波法提取率高。殷东林等[30]以蛹虫草子实体干粉为材料，提取剂为70%乙醇，然后通过正交试验进一步研究，最终确定的最佳工艺为微波功率350 W、处理4 min、提取2次、料液比1∶50，提取率高达6.87%。张凤清等[31]选用北冬虫夏草子座为材料进行虫草素提取，结果显示超高压萃取效果最佳，其工艺为压力500 MPa、容积体积分数50%、料液比1∶75、提取时间2 min，提取率达到5.5 　　mg·g-1。
　　3 虫草素分离纯化
　　自Cunningham[3]在1951年用活性炭和交换树脂首次分离出虫草素以来，各种分离方法不断涌现，各有利弊，不断发展。目前常用的虫草素分离纯化方法有多种，其中比较高效的方法有超临界萃取法、离子交换树脂吸附法、大孔吸附树脂法。
　　离子交换树脂吸附法关键在于选择合适的离子交换树脂。车振明等[32]用732NH4+型阳离子交换树脂提取，但提取的虫草素得率较低，只有81%。毛宁等[33]采用JK006阳离子与717阴离子交换树脂相配合，得到纯度达96.4%的虫草素。
　　大孔树脂的选择要与目的成分极性相似[34]。曾昱等[35]利用大孔吸附树脂法，填料XAD16树脂，得到的虫草素纯度达到98%以上。刘艳芳等[36]采用NKAII型大孔树脂分离虫草素，反复结晶得纯度达98%以上。李学军等[37]采用ML7大孔树脂纯化虫草素纯度可达到92%以上。
　　此外，超临界萃取技术发展迅速，陈顺志等[38]利用超临界萃取技术以蛹虫草人工培养后的发酵物为原料，获得的虫草素晶体纯度为50.0%～99.9%，该技术无污染，易操作，但成本高，不利于工业化生产。
　　虫草素分离纯化方法有多种，每种方法各有利弊，可多种方法联用。徐文豪等[39]采用离子交换树脂、大孔吸附树脂处理和多次硅胶柱层析、薄层分离法得到核苷类物质，虫草素是核苷类物质的一种，因此也可用于虫草素分离[40]。
　　4 虫草素测定
　　虫草素作为一种生物活性物质，测定含量的方法有多种。目前主要的测定方法有高效液相色谱法（HPLC）、高效毛细管电泳法（HPCE）、薄层色谱法（TLCS）、TLCSHPLC联用法。其中最常用的是高效液相色谱法（HPLC），精密度与准确度高，一般采用反相色谱法，以十八烷基键合硅胶为固定相，流动相有多种，采用C18填料的色谱柱，填料粒为5 mm，柱子直径4.6 mm，柱子长为150 mm和250 mm，流动相为甲醇、水或甲醇、磷酸缓冲液，检测波长为254、259和260 nm，检测温度为20～40℃，柱流速为0.5～1.0 mL·min-1，进样量5～20 L[41]。
　　5  蟲草素产量提升优化
　　5.1 高产菌种的选育
　　提高虫草素含量非常重要的措施之一就是获得稳定遗传的高产菌株。据现有的研究报道，蛹虫草菌种选育的方法主要有化学试剂诱变、辐射诱变等。
　　Das等[42]采用高能离子束诱变蛹虫草，获得比对照组高72%的突变株。刘金彬等[43]利用离子束、亚硝基胍及离子束亚硝基胍诱变法处理蛹虫草Cordyceps militaris JN168，获得几株较高产菌株，每组诱变都能提高虫草素产量，最后获得的复合诱变菌2，经过优化液体发酵，产量提高了5倍，高达1045.65 mg·L-1。曹照平等[44]用蛹虫草FFCC5111 为出发菌株，通过 200 W 、22 kHz超声强度联合1% DES 复合诱变获得突变株，经发酵培养，突变株FFCC5111c 产生的虫草素比亲株提高44.5%，高达4.142 g·L-1。此外，温鲁等[45]研究航天搭载蛹虫草进行诱变，虫草素产量比原始株提高了2.5倍。
　　5.2 优化培养条件
　　当前虫草素的生物合成途径主要有2种：一种是固体培养的子实体中提取，但虫草素含量一般只有0.5%左右或者更低[46]，因此难以满足市场需求。二是菌丝发酵液中提取，97%～98%的虫草素分泌在发酵液中，且液体发酵周期短，产量较子实体中高。
　　秦鹏等[47]利用响应面法优化蛹虫草液体发酵条件，得出虫草素积累量达到852.621 μg·mL-1，其优化培养条件：KNO3 0.04 g、酵母浸膏1.50 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、KH2PO4 0.2 g·mL-1、葡萄糖3.82 g、ZnSO4·7H2O 0.06 g、MgSO4·7H2O 0.13 g、维生素B1 0.08 g，（含量均是按100 mL计）;同等条件下，发酵8 d、静置10 d后，虫草素积累量高达936.225 μg·mL-1。汤佳鹏等[48]研究蛹虫草表面液体发酵结果表明组合使用0.55 mg·L-1三十烷醇、22.64 mg·L-1 赤霉素与 1.69 mg·L-1  6苄基腺嘌呤的组合是最有利于虫草素积累的组合，虫草素最大产量达到 7.31 g·L-1。闫瑞等[49]研究在蛹虫草FFCC5111液体发酵添加前体物，结果表明，添加腺苷、苯丙氨酸、腺嘌呤、甘氨酸和L谷氨酰胺均可提高虫草素产量，其中添加腺苷1.5 g·L-1的发酵液中虫草素产量最高，为772.5 mg·L-1，是对照组的9.39倍。据秦鹏、王龙等[50]的专利，利用腺嘌呤补料公式配比补料发酵液，其优化配方：葡萄糖35 g、蛋白胨17 g、腺嘌呤2 g、甘氨酸14 g、KH2PO4 1 g、MgSO4·7H2O 1 g、pH值自然，制得发酵滤液虫草素产量达到 956.020 μg·mL-1，对照提高了535.66%。Masuda等[51]在基本培养基中加入1 g·L-1腺嘌呤和16 g·L-1氨基乙酸，使得虫草素产量提高了4.1倍。陈长兰等[52]分析了蛹虫草液体摇瓶过程中分别添加20种含量0.2 g·100-1 mL的氨基酸，结果表明精氨酸、组氨酸、苏氨酸、天冬氨酸及丙氨酸的添加对虫草素产量增加。周思静等[53]研究在蛹虫草液体培养基中加入金属离子，结果表明添加Mn2+、Ca2+、Mg2+能够显著（P<0.05）提高蛹虫草液体培养胞外虫草素产量，最适浓度分别是0.05、0.6、1.0 g·L-1。阮元等[54]研究了添加不同浓度的维生素B1、B6和2，4D到常规培养基中，结果显示中维生素B1和B6 的最佳添加浓度均为 0.83 g·L-1，2，4D 的最佳添加浓度为 0.015 mg·mL-1，此外还对比了灭菌前、后各添加维生素 B1，发现灭菌前的比灭菌后的虫草素产量提高了19.9%。表明维生素B1的分解产物对虫草素合成有促进作用。蔡水淋等[55]通过设计优化蛹虫草液体深层发酵工艺，结果发现无机盐FeSO4对虫草素产量影响最显著。 　　6 总结与展望
　　现代研究已表明，虫草素具有多重药理作用，包括抗菌、消炎、抗肿瘤、抗病毒、提升人体免疫力等功效，因此，在食品、医药、保健品等方面都有着巨大的开发价值和广阔的市场前景。虫草素自被发现有特殊的功效以来，引起国际上的专家学者的极大关注，对其研究也是多方面的，包括有提取制备、生物活性、药用价值、作用机理以及开发应用等[25]。虫草素提取制备主要研究高效的提取方法，以期更多的产量和更高的纯度。虫草素疗效显著，但大量分离获得纯品比较困难，导致市场虫草素价格非常昂贵。虫草素的合成途径复杂，目前的研究报道绝大多数是利用生物合成途径，主要以发酵菌丝的方式来获取。但是以传统的方法发酵菌丝虫草素产量低下，不能满足市场需求。因此，优化培养发酵条件，缩短周期，获得更高产的产虫草素的培养方式是将来发展的方向。市场上有着很多虫草素开发的产品，只要是对人类健康有益的都会被接受，有重要的社会意义。总之，虫草素的研究与开发已取得喜人的成就，随着技术发展会有更广阔的市场前景。
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