不同镁浓度对烟叶氮代谢关键酶活性的影响

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　　摘 要：为了研究镁对烤烟叶片氮代谢关键酶的影响，以烤烟品种K326为试验材料，采用水培方式，设置不同Mg.2+浓度处理，测定了与氮代谢中相关的硝酸还原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）活性。结果表明：在烤烟的生长的不同时期，NR活性呈先降低后升高再降低的趋势，GS活性呈先降低后升高的变化趋势，GOGAT活性呈逐渐减弱的趋势;在同一时期，不同Mg.2+浓度处理下烟叶NR活性有显著差异， Mg.2+浓度为6 mmol/L时NR活性和GS活性最强，镁浓度的升高有利于GOGAT活性增强。结果表明Mg.2+浓度为6 mmol/L时，可提高烟草植株氮代谢关键酶的活性，促进无机氮向有机氮的转化。
　　关键词：烤烟;镁浓度;硝酸还原酶;谷氨酰胺合成酶;谷氨酸合成酶
　　中图分类号：S572
　　 文献标识码：A
　　文章编号：1008-0457（2019）02-0048-04     国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.02.009
　　Abstract：  In order to study the effect of magnesium on key enzymes of nitrogen metabolism in tobacco leaves， using flue-cured tobacco variety K326 as experimental material，hydroponics experiment with treatment of different magnesium concentration was conducted， and the activities of nitrate reductase （NR）， glutamine synthetase （GS） and glutamate synthase （GOGAT） related to nitrogen metabolism were determined. The results showed that NR activity decreased first， then increased and finally decreased， while GS activity decreased first and then increased， and GOGAT activity decreased gradually during the whole growth process of tobacco. At the same stage， there were significant differences in the NR activity among different treatments. NR activity and GS activity were the strongest when Mg.2+ concentration was 6 mmol/L， the increase of magnesium concentration was beneficial to the activity of GOGAT. The results indicated that Mg.2+ with the concentration of 6 mmol/L could increase the activity of key enzymes in nitrogen metabolism of tobacco plants， promoting the conversion of inorganic nitrogen to organic nitrogen.
　　Key words：tobacco; magnesium concentration; nitrate reductase; glutamine synthase; glutamate synthase
　　鎂是植物必需营养元素，缺镁或过量胁迫均会影响植物叶片的生长发育[1]，镁过量则会导致烟叶储存时吸湿性增强[2-3]。镁对氮代谢及其产物有着重要的影响，镁可以稳定核糖体结构，为蛋白质的合成提供场所;在氨基酸的活化、多肽链合成的启动和多肽链的延长等蛋白质合成过程中，也需要镁的参与;镁也能激活谷氨酰胺合成酶;在固氮过程中，铁氧还原蛋白则与Mg-ATP结合，向固氮酶的活性中心提供能量和传递电子[4]。在氮代谢中包含了无机氮的还原、同化及有机含氮化合物的合成、转化和分解的过程[5]。氮素还原过程是氮代谢的重要环节，是将植物体内的硝态氮还原成氨的过程[6]，氮同化则是将氨最终同化形成氨基酸的过程。硝酸还原酶（NR），谷氨酰胺合成酶（GS）及谷氨酸合成酶（GOGAT）是影响氮代谢的关键酶，硝酸还原酶作为氮代谢的限速酶，可调节NO.-的还原，从而调节氮代谢[7]。氮素同化过程中，谷氨酰胺合成酶将NH4.+同化形成谷氨酰胺，然后进一步转化成谷氨酸，形成氨基酸，进而形成不同的蛋白质[7]。因此，NR和GS活性的强弱对氮素利用具有重要影响。本文采用水培的方式，控制体系的养分离子浓度及pH条件，研究不同镁浓度对氮代谢关键酶的影响，从而为合理施用镁肥提供参考依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 供试材料
　　供试烤烟品种为K326，试验于2017年在贵州省平坝县贵州大学烟草试验基地进行。
　　1.2 试验设计
　　采用水培方式进行试验，水培营养液以B.Hoagland配方为基础调整后使用。根据镁离子浓度设置0、2、4、6、8、10 mmol/L共6个处理，重复3次。
　　采用30 cm×30 cm 的培养盆，上面采用定植板和定植网固定烟苗，烟苗通过定植孔中的定植网固定在板上，每盆装营养液5 L，栽植1株烟苗。烟苗长至4叶1心时移植。营养液用蒸馏水配置，各种养分均用分析纯（AR）试剂提供。营养液每7天更换一次，伸根期每天充氧5分钟，其他生育期每天充氧10分钟。 　　1.3 样品采集及测定方法
　　移栽后待烟苗长至伸根期（5月26日）、团棵期（6月10日）、旺长中期（7月1日）、现蕾期（7月14日），取中部叶片经液氮处理后，储藏于-78℃低温冰箱中用于硝酸还原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合成酶（GOAST）活性的测定。称取0.1g烟草叶片用液氮研磨至粉末状，采用试剂盒（苏州科铭）提取组织样品的原液，NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐能够在酸性条件下，与对—氨基苯磺酸及α—萘胺定量生成红色偶氮化合物;产生的红色偶氮化合物在540 nm有最大吸收峰值。GS在ATP和Mg.2+存在下，催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺;谷氨酰胺进一步转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，在酸性条件下与铁形成红色的络合物;该络合物在540 nm处有最大吸收峰。GOGAT催化谷氨酰胺的氨基转移到α—酮戊二酸，形成两分子的谷氨酸，同时NADH氧化生成NAD+，340 nm吸光度的下降速率可以反映GOGAT活性大小。经试剂盒的待测液用酶标仪（Bio Tek EON）测定各指标。每个指标均测定3次。
　　1.4 数据统计分析
　　采用Excel 2010和DPS7.05进行统计分析。
　　2 结果与分析
　　2.1 镁浓度对烤烟叶片NR活性的影响
　　NR是植物体内将硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是限速酶，其活性高低反应了植物体氮代谢状况。由不同处理下烤烟叶片NR活性（图1）可看出，随着烤烟生育期的延长，NR活性呈先降低后升高再降低的趋势，表明烤烟生育前期氮代谢旺盛，NR活性最强。
　　不同镁浓度对NR活性是有影响的，在伸根期，随着镁浓度的升高，NR活性呈下降趋势，T1处理与其他处理差异均达到显著水平，T2处理与T3，T5，T6处理均达到差异性显著，且T1处理NR活性显著高于其它处理，T2处理NR活性显著高于T3、T4、T5、T6处理。在团棵期、旺长中期，虽然各处理间NR活性差异均未达到显著水平，但团棵期T1处理下的NR活性最高，随着镁浓度的升高，NR活性仍表现出下降趋势;在旺长中期，T1～T3处理NR活性较低，T4～T6处理随镁浓度的升高NR活性呈下降的趋势。现蕾期随镁浓度的升高，各处理间差异不显著，NR活性变化的趋势趋于稳定。由此可以看出，NR活性在T4处理时活性更强一些，而在T5和T6处理下，NR的活性会受到抑制。说明适量增施镁肥，在烟叶生长最关键的旺长中期可提高叶片 NR活性，促进烟株氮代谢，Mg.2+浓度为6 mmol/L 的T4处理效果最佳，而当Mg.2+浓度超过6 mmol/L时会抑制NR的活性。
　　2.2 镁浓度对烤烟叶片GS活性的影响
　　GS是植物体内氨同化的关键酶，其活性控制着植物体内氮素的运转和分配。不同镁浓度处理下的烤烟叶片GS活性显示（图2），烤烟的整个生长时期中，各处理的GS活性变化趋势基本一致，呈先降低后升高的变化趋势，在团棵期活性最低，而在现蕾期达到最高值。
　　不同处理对GS活性的影响有差异：伸根期除T4处理的GS活性显著低于T6处理外，与处理相比差异均不显著;在团棵期，T4、T6处理间的GS活性差异不显著，但显著低于T3、T5、T2、T1处理，而T3、T5、T2、T1处理间差异不显著;在旺长中期，T5处理的GS活性显著高于其余5个处理，T4处理次之，T3处理最低;在现蕾期，T4处理的GS活性显著高于其余5个处理，T3处理次之，T5处理最低。说明在旺长中期和现蕾期，Mg.2+浓度为6 mmol/L 的T4处理最有利于促使更多的无机氮转化为有机氮，降低烟叶中游离铵离子积累。
　　2.3 镁浓度对烤烟叶片GOGAT活性的影响
　　GOGAT同样作为植物体内氮素同化与循环的关键酶，在GS/GOGAT循环中，GOGAT是该途径的限速酶。不同镁浓度处理下烤烟叶片GOGAT活性（图3）可看出，在团棵期至现蕾期，GOGAT的活性均呈逐漸减弱的趋势。
　　在伸根期，处理间差异达到显著， T2处理GOGAT活性最强，T5处理次之，T6处理的GOGAT活性最弱;在团棵期，处理间差异也达到显著，T5处理GOGAT活性最强，T3处理次之，T2处理的GOGAT活性最弱;在旺长中期，各处理间差异缩小，但也达到显著水平，T3处理的GOGAT活性最强，T6处理次之，T4处理最弱;现蕾期各处理间GOGAT活性差异显著，T3处理的GOGAT活性最强，T6处理次之，T1处理最弱。不同生育期GOGAT变化较为复杂，并未随浓度表现出明显的规律性，但可以看出，添加镁的处理GOGAT活性均高于T1，说明Mg.2+浓度的提高是可以促进GOGAT活性，有利于氮素同化的。
　　3 结论与讨论
　　氮代谢是植物的重要生理代谢之一，且在各个环境中生长的植物机体内都具有重要作用[8]。氮代谢可为碳代谢提供光合色素和酶，从而与碳代谢共同促进植物的生长发育[9]。镁作为叶绿素卟啉环的中心原子，只有镁原子同叶绿素分子结合后，才具备吸收光量子的必要结构，才能有效地吸收光量子进行光合碳同化反应。植物只有正常的进行光合作用，烤烟才能进行将无机碳转化为有机碳的同化代谢。本研究结果表明不同镁离子浓度对氮代谢中的硝酸还原酶，谷氨酰胺合成酶以及谷氨酸合成酶均有影响。
　　硝酸还原酶的活性与光合作用有密切关系，在叶绿体中硝酸盐的还原作用主要依赖与光合作用提供的还原力。当镁离子含量低时，不能更好地与叶绿素分子结合，从而会影响光合作用，最终会影响氮素还原。硝酸还原酶作为氮代谢过程的第一个酶，其活性较低，对外部条件敏感，较不稳定，所以硝酸还原酶的活力对硝酸还原有一定的限制作用，其活性强弱会直接影响氮代谢能力的高低[10-11]。在植物体各部位中硝酸还原酶活性也有所不同，一般在幼嫩组织中，硝酸还原酶活性高，而在衰老组织中的活性较低[12]。试验结果表明，随烤烟的生长，各处理间硝酸还原酶活性变化趋势基本一致，呈先降低后升高再降低的趋势，烤烟生育前期氮代谢旺盛，NR活性最强。在镁离子浓度为6 mmol/L时，硝酸还原酶活性最强，镁离子浓度大于6 mmol/L，硝酸还原酶的活性将会受到抑制。这说明适量的Mg.2+可促进NR的活性。而NR活性的增强有利于氨基酸的合成并促进植物生长[13]。 　　经过硝酸还原酶对NO3.-的还原后，最终经亚硝酸还原酶将NO2.-还原为NH4.+，进入氮同化途径。在同化NH4.+时，GS和GOGAT同时起作用[14]，GS/GOGAT途径是植物氨同化的重要方式，是发生在叶绿体中的连续反应。谷氨酰胺合成酶对氨有高的亲和力，可保证叶绿体中NH3维持在很低的水平，所以GS作为谷氨酰胺合成的关键酶，可以提高氮素利用率。而镁在此过程中，其主要作用是激活谷氨酰胺合成酶，因此镁在氮代谢的同化过程中也具有重要的作用。有研究表明[15]，氮代谢关键酶GS活性强，氮的同化能力就强，氮素利用率较高。在对谷氨酰胺合成酶的分析中，可以看出，GS的活性并没有在某一个浓度的所有时期达到最大值，而在NR活性最强的6 mmol/L处，伸根期和团棵期的GS活性最弱，说明在Mg.2+浓度为6mmol/L时，烟株生育前期氮还原能力较强而氮同化能力较弱，氮素利用率低。而GS活性在旺长中期呈逐渐增强的趋势，且在现蕾期，GS的活性在镁离子浓度为6 mmol/L达到最强，这说明在烟草后期生长中，浓度为6 mmol/L的镁离子可更好的激活谷氨酰胺合成酶，提高GS活性，增强氮同化，提高氮素利用，这有利于干物质的积累。
　　GOGAT作为氮素同化中同样重要的酶，在氮素同化中与GS共同起作用，它在GS/GOGAT循环中为限速酶[16-17]。在本试验中，不同生育期GOGAT活性随镁浓度的增加并未表现出明显的规律性，这可能是由于经GOGAT将谷氨酰胺和α-酮戊二酸转变为2分子谷氨酸后，一份子谷氨酸用作GS的底物，另一谷氨酸用于合成蛋白质，核酸等含氮化合物中，在不同时期的不同浓度下两个途径所分配的谷氨酸含量有所不同，所以GOGAT活性随镁浓度的变化没有明显的规律，且GOGAT活性变化与镁浓度的高低无关。但是添加镁的处理GOGAT活性均高于T1处理，说明Mg.2+浓度的提高可促进GOGAT活性，有利于氮素同化。
　　综上所述，在烟株生长过程中，当Mg.2+浓度为6 mmol/L时，可增强氮代谢关键酶活性，促进无机氮向有机氮转化，提高氮素利用率。
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