抗虫转基因水稻检测技术研究综述

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　　摘  要：近年来，随着抗虫转基因水稻研究的进一步发展，世界各地实验室在抗虫转基因水稻研究方面均有收获，抗虫转基因水稻检测随之成为众多科学家的关注点。该文综述了抗虫转基因水稻检测技术的研究进展，为进一步开展转基因水稻检测的研究工作提供参考。
　　关键词：抗虫 Tail-PCR;转基因水稻;基因芯片;检测技术
　　中图分类号  S511 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）10-0015-04
　　稻米是全世界近一半人口消费的主要粮食作物，对于人类的生存和发展起着极其重要的作用，是我国食用人口比重最大的粮食作物。研究表明，当前制约水稻稳产、高产以及稻米品质的主要是各类害虫，所以防治虫害成为了重中之重。在防治害虫时，使用生物防治手段，不仅制约因素多、还不易控制，而使用化学农药不仅破坏生态平衡、还可以使螟虫产生抗性;培育抗虫水稻新品种，增强水稻的抗虫性，是一种更经济环保的方法。然而，传统的抗虫水稻育种周期长，有限的遗传资源，不明确的抗虫机制，还会产生新的生物型害虫，导致抗虫性不稳定，极大地制约了水稻抗虫育种的进程。因此，利用基因工程技术获得转基因抗虫水稻，是水稻防虫侵害的最有希望和前途的方法。
　　1 抗虫转基因水稻简介
　　抗虫转基因水稻就是利用转基因技术将抗虫基因导入水稻的受体细胞中，使寄主在水稻细胞内抗虫基因得到表达并遗传，使水稻自身产生抗虫蛋白，进而形成抗虫的新型水稻品种。在水稻转基因抗虫研究中，被广泛应用的水稻抗虫基因是从苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）中发现的Bt基因。1989年，人类第一次培育转基因水稻植株，此植株是由中国农業科学院杨虹等将Bt基因利用原生质体电融合技术导入粳稻台北309的基因组DNA中培育出的新型水稻[1]。现至今已有多个实验室成功培育出转基因水稻新品种。金永梅等[2]将 Cry1C*、 Cry2A*这2个不同的Bt抗虫基因利用农杆菌介导法同时导入到水稻品种吉粳88中去，获得了二价抗虫转基因水稻。2005年华中农业大学张启发院士课题组，将水稻Actin启动子驱动的融合型Bt抗虫基因cry1A（b）/cry1A（c）导入籼型恢复63中，得到了一些基本不用药物防治螟虫危害的转化植株[3]。2009年底，2个由华中农业大学研发的抗虫转Bt基因水稻“华恢1号”和“Bt汕优63”，首次获得农业部为转基因水稻颁发的安全证书，标志着转Bt基因水稻以成功进入中国。2015年1月5日，“转基因抗虫水稻“再次获得由农业部颁发的农业转基因生物安全证书（生产应用），2018年，转基因抗虫水稻华恢1号获得美国FDA的商业化许可。2002年，我国农业部和卫生部同时发布了《农业转基因生物标识管理办法》、《转基因食品卫生管理办法》2部法规，内容规定强制进行转基因食品标识[4-5]。表明抗虫转基因水稻的培育和应用需要转基因水稻的检测技术。就转基因基因检测技术来说，发达国家技术水平高于发展中国家，美国等发达国家向发展中国家出口了大量抗虫转基因产品。中国已经加入了WTO，必然面临着转基因产品贸易和安全监控的挑战[6-8]。
　　2 抗虫转基因水稻检测技术研究进展
　　抗虫转基因水稻检测主要内容是检测抗虫基因（Bt基因）是否存在以及含量，还要确定其是否能成为合格的转基因新品种等[9]。随着科技的不断发展，植物基因工程技术领域里不断研究出新的转基因植物检测技术，检测范围发展到DNA水平、RNA水平和蛋白质水平3个方向。检测方法主要有PCR检测方法、Souther杂交、Tail-PCR、基因芯片、RT-PCR检测、实时荧光定量PCR检测、Nouther杂交、ELISA方法、试纸条检测法等。
　　2.1 蛋白质水平检测
　　2.1.1 ELISA检测法 通过欧洲多个实验室研究结果可以确定，运用ELISA方法检测Bt蛋白含量结果可信度几乎达到100%，目前普遍应用ELISA检测法检测抗虫转基因水稻Bt蛋白含量。2018年黑龙江大学李荣田等使用ELISA方法检测出不同Bt基因在植物细胞蛋白质层面的表达量（或最高表达量）是有差别的[10]。ELISA检测法是通过实验结果是否发生颜色反应及生成物质颜色变化的深浅来判定检测信号的存在和含量的。抗虫转基因水稻表达的目标蛋白（抗原）和抗体存在特异性反应，结合了酶和底物之间高效催化作用，也就是说加入酶催化底物后，底物就会发生反应并且生成有颜色的物质，酶含量和生成物质颜色深浅呈正比，间接显示了目标蛋白含量的多少。因此，ELISA检测法即可以定性检测抗虫基因是否存在，也可以定量分析抗虫基因表达量[11]。该方法现在已经推广试剂盒的应用，可快速实验并且准确度高。
　　2.1.2 试纸条法 试纸条法是将含有特异抗体的蛋白提取液交联到试纸条和有颜色物质上，当纸上抗体和蛋白提取液中特异抗原结合之后，再与特异的带有颜色的抗体进行反应，于是就在试纸条上出现了三明治状的色带。假如没有抗原，就没有三明治色带。中国科学院王彤彤[12]采用快速检测试纸条，仅仅需要5min就可以准确测定出抗虫转基因水稻中Bt蛋白含量。由此可见，试纸条法可以在现场进行检验或初筛时，不需特殊的仪器设备就可以完成实验，将来有着较好的应用前景。
　　2.2 RNA水平检测
　　2.2.1 半定量RT-PCR检测 这是一种通过检测特异性mRNA的灵敏度来分析基因表达的快速方法。此方法首先提取抗虫转基因水稻总RNA，然后以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA;再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达产物，最后通过限制性内切酶酶解或者核苷酸测序来进一步鉴定PCR产物[13]。半定量RT-PCR技术虽然快速简便，但是它是一种粗略的估计基因表达量的方法，若要精确计算基因表达量，还需要定量PCR技术。 　　2.2.2 实时荧光定量PCR检测 实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统PCR中不能定量检测的局限性，其原理是在普通PCR反应中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，然后通过标准曲线就可以对未知模板进行定量分析[14]。中国农业科学院苏长青博士建立了转基因抗虫水稻科丰8号实时荧光定量PCR检测方法，并用此方法确定了科丰8号品系外源抗虫基因为10拷贝[15]。因此，实时荧光定量PCR技术是外源基因定性定量分析先进技术，其优势在于准确性高、假阳性低、特异性好、灵敏度高。因为应用荧光信号检测对样品初始模板浓度进行定量，能够使结果误差小;过程中操作简单、自动化程度高;整个反应在闭管条件下一步反应完成，既不会交叉污染，更保护了实验环境[16]。
　　2.2.3 Northern杂交 Northern杂交是一种通过检测RNA的表达水平来检测外源抗虫基 因表达的方法。假如整合到水稻染色体上的外源抗虫基因能正常表达，那么转化水稻植株细胞内有其特异转录产物生成。首先，将提取的植物总RNA用变性凝胶电泳分离;然后，将凝胶上不同排布的RNA分子按照原位转移到固定膜上，在适宜的离子强度及温度条件下，特异性标记的探针会与膜上的同源序列进行杂交;最后，通过探针的标记性质就可以检测出杂交体，而且转录的特异性RNA分子量的大小可以直接通过杂交体在膜上的位置来判断。若无杂交，样品无杂交带出现，表明外源基因已经整合到水稻细胞染色体上，只是外源抗虫基因在某些部位和特定生理状态下并未有效表达，不能说明外源基因不表达，需要接下来的实验进一步判断[17]。
　　2.3 DNA水平检测
　　2.3.1 简单PCR技术 简单PCR技术是抗虫转基因水稻外源基因检测最成熟、基础的一项检测。黄晓西[18]运用简单PCR技術检测了转新型Bt基因抗虫水稻146株，转化率达32.8%。其原理是体外利用极少量DNA模板酶促合成特异DNA片段，设计特异性引物，添加催化DNA聚合酶，经过高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，达到目的基因片段快速扩增的过程。简单PCR技术只能满足一种或少数几个转基因品种的检测需要，并且检测结果一旦出现假阳性的缺陷，就会导致工作程序重复验证，耗费大量时间，现在除简单的定性鉴定之外，已不能满足当前工作中快速通关的要求。
　　2.3.2 多重PCR技术 多重PCR技术是在常规PCR基础上发展出能够同时扩增多个核算片段的一种新型PCR技术。在应用时要求使用至少两对熔解温度相近、彼此不发生相互作用的2队引物，并且扩增产物分子量大小即相近又能通过电泳分离。反映到植物基因工程应用，水稻中的内参基因、外源基因、355启动子、NOS终止子可以在同一个PCR体系中同时用多套引物分别扩增出来。敖金霞[19]建立了适用转基因大豆、玉米和水稻深加工产品定性检测的5重巢式PCR检测方法，其检测灵敏度为0.005%。此方法简化了操作程序，既节省了模板DNA，又减少费用，是一种非常有发展前景的定性PCR检测方法[20]。
　　2.3.3 Southern Blot杂交 Southern Blot通常被用来鉴定外源基因在抗虫转基因水稻中的整合情况，即检测抗虫基因整合在水稻基因组中的拷贝数情况。其基本原理是首先用限制性内切酶将水稻基因组酶切消化，标记目的基因片段为探针备用，然后将消化的基因组DNA与标记好探针在杂交膜上进行杂交，包含目的基因的基因组片段与探针会因为发生同源重组而显示杂交信号，目标基因拷贝数就自然得出。因此，金永梅[21]等利用Southern Blot技术检测出单拷贝抗虫水稻植株，以此为前提，确定出外源抗虫基因的插入位点。该技术虽然操作程序复杂，周期长和成本高，但是因其高度准备性，因此一直以来都被认为是筛选阳性转基因植株最为可靠、稳定的方法[22-24]。
　　2.3.4 Tail-PCR Tail-PCR是可以确定外源抗虫基因它插入水稻基因组位置的技术。吉林省农业科学院金咏梅马瑞等利用Tail-PCR方法，将转cry1C基因抗虫水稻吉生粳3号的左、右边界旁侧序列，依据旁侧序列确定T-DNA在基因组中的插入位点，并建立吉生粳3号品系特异性 PCR方法。利用农杆菌遗传转化方法导入的外源抗虫基因在宿主水稻基因组的插入位点是随机的，每个转化事件中外源抗虫基因和水稻基因组DNA拼接组成的旁侧序列具有唯一性。T-DNA整合过程是一个复杂的异常重组过程，包括水稻基因组整合位点的删除和重复，T-DNA序列的删除和重复，以及水稻染色体上的易位和到位等现象。染色体步移（Chromosomewalking）是指从生物基因组或基因组文库中的已知序列出发，逐步探知其旁邻的未知序列或与已知序列呈线性关系的目标序列的方法。分离旁侧序列的染色体步移方法主要采用染色体步移技术中的半随机引物PCR策略。半随机引物PCR策略中的热不对称交错PCR（Tail-PCR）是将目标序列旁的已知序列中设计的3个嵌套的特定引物（specialprimerSP1，SP2，SP3）分别与1个具有低Tm值的随机简并引物相结合，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异产物的方法。根据所分离的旁侧序列，通过与NCBI 的比对分析确定T-DNA在基因组中的整合位点。该序列是不同转基因作物品系的特异性身份标识，根据其建立的品系特异性检测方法能快速、准确地鉴定不同的转基因作物品系[25-26]。利用Tail-PCR技术检测抗虫转基因水稻，保证了抗虫转基因水稻检测的准确性和专一性，为监管抗虫转基因水稻的育种、生产、加工和销售提供了可靠的技术支撑[27-28]。利用外源抗虫基因在水稻基因组上整合位点的唯一性，可以建立抗虫转基因水稻品系特异性检测方法，该方法可以根据外源抗虫基因与旁侧水稻基因组连接区序列为靶标设计引物，使用Tail-PCR方法扩增出对照和抗虫转基因品系特异的PCR条带[29]。目前，我国抗虫转基因水稻安全试验阶段过程中，要求提供转入外源抗虫基因提供插入位点碱基序列。因此，Tail-PCR技术是转基因抗虫水稻商品化不可或缺的一项技术。 　　2.3.5 基因芯片 当常规的一些检测方法需要操作繁琐的转膜、杂交等，费用高同时不能快速精准的检测，有些方法更不适合大批量样品的检测。最近几年发展起来一种专门用来检测核酸的生物芯片，亦称基因芯片，是多学科交叉融合产生的高新技术产品。基因芯片是利用核酸互补杂交原理研制的，其原理是在一块固相支持介质表面固定已知序列的DNA/RNA片断，形成DNA/RNA微矩阵，即核算探针;将荧光标记分子通过体外转录或扩增等技术掺入到样品RNA或DNA当中，与位于微阵列上的已知DNA核酸探针序列杂交，通过荧光显影法等对杂交信号强度进行检测分析，获得序列完全互补的探针序列，再用计算机软件比较和综合分析数据后，即可获得样品中分子数量和大量基因表达信息[30]。目前，将通用的报告基因、抗虫基因、启动子和终止子的特异片断制成检测芯片与待测产品的DNA进行杂交，杂交信号由扫描仪扫描后再经计算机软件进行分析，就可以判断待测样品是否为抗虫转基因水稻。
　　3 小结与展望
　　转基因抗虫水稻检测涉及到的检测内容主要是蛋白质检测和核酸检测。蛋白质检测主要利用抗原抗体特异性反应原理进行，实验操作简便、快速，结果准确可靠。在核算检测方面，PCR技术经过不断优化后，定性、定量检测检测范围更广，具有特异性好，灵敏度高等优点被广泛使用。近年来发展的Tail-PCR技术，虽然建立在Southern Blot技术基础之上，可是能够定位抗虫基因的位置，这在技术领域上是一大突破。基因芯片技术虽然成本高，数据分析复杂，但是其优势在于高密度、高通量，用量少，快速而且准确。因此，今后转基因检测技术研究的发展趋势必然是将各种检测技术结合起来，建立更加高效、快速、便捷、高通量、低成本的新检测方法。
　　参考文献
　　[1]杨虹，李家新.苏云金芽孢杆菌δ-内毒素基因导入水稻原生质体后获得转基因植株[J].中国农业科学，1989，22（5）︰1-5.
　　[2]金永梅，马瑞，于志晶，等.利用农杆菌介导的共转化法获得含双 Bt基因转基因水稻[J].吉林农业科学，2014，（5）︰26-29.
　　[3]陈浩.三种Bt基因（cry1Ac、cry2A*和cry9C*）抗虫水稻的培育及评价[D].武汉：华中农业大学，2005.
　　[4]农业部农业转基因生物安全管理办公室.农业转基因生物标识管理办法[EB/OL].[2010-11-12].htto：//www.moa.gov.cn/ztzl/zjyqwgz/zefg/2010007/t20100117-1601302.htm.
　　[5]中华人民共和国卫生部令.转基因食品卫生管理办法[EB/OL].[2011-11-12].htto：//www.chingrain.gov.cn/n16/nll07/n2309/n2309/n2609/90945.html.
　　[6]邓汉超.转基因植物DNA成分检测技术研究进展[J].中国种业，2016（11）：19-21.
　　[7]侯大军，李洪军.转基因食品的发展历史与未来趋势[J].四川食品与发酵，2007（5）：24-27.
　　[8]杨铭铎，张春梅，华庆，等.转基因食品快速检测技术的研究进展[J].食品科学，2004，25（11）：424-427.
　　[9]唐丁，郭龙彪，钱前.水稻转基因技术与转基因水稻[J].中国稻米，2005（5）：5-7.
　　[10]李荣田，王宇新，等.转cry1C*及cry2A*基因早粳稻Bt蛋白的时空表达和抗螟虫性[J].作物学报，2018，44（12）：1829-1836.
　　[11]LIPPM.IUPAC.collaborative trial study of a method to deteet genetieally mod ified oybeans and maize in dried Powder.JAOAC Int，1999，82：923-928.
　　[12]王彤彤.农杆菌介导转抗虫基因粳稻转化材料的培育[D].北京：中国农业科学院，2014.
　　[13]吴影.Bt基因的组织特异性表达及转基因水稻分子检测方法的研究[D].合肥：安徽农业大学，2006.
　　[14]柳爱春，赵芸，刘超，等.双重一步法RT-PCR检测两种主要兰花病毒[J].杭州农业与科技学报，2009，03.
　　[15]苏长青.适合转基因抗虫水稻和棉花PCR检测标准质粒的构建及适用[D].北京：中国农业科学院，2011.
　　[16]蒋春燕.实时荧光定量PCR技术[J].动物医学进展，2005，26（12）：97-101.
　　[17]宫本贺.转基因苾蔴的分子检测和抗虫鉴定[D].北京：中国农业科学院，2010.
　　[18]黄小西.转新型Bt基因水稻的获得和初步筛选[D].雅安：四川农业大学，2017.
　　[19]敖金霞，高学军，于艳波，等.转基因大豆、玉米、水稻深加工产品的五重巢式PCR技术检测[J].中国农业大学学报，2010（2）：93-99.
　　[20]N.Crickmore，D.R.Zeigler，J.Feitelson，et al.Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins[J].Microbiologyand molecular biology reviews，1998，62（3）： 807-813.
　　[21]金永梅，馬瑞.转cry1C基因抗虫水稻吉生粳3号外源基因整合分析与品系特异性检测[J].生物技术通报，2018，07：88. 　　[22]Xu D，Xue Q，McElroy D.Constitutive expression of a cowpea trypsin inhibitor gene，CpTi，in transgenic rice plants confers resis-tance to two major rice insect pests[J].Mol Breeding，1996，2：167-173.
　　[23]Lee S I，Lee S H，Koo J C，et al.Soybean Kunitz trypsin inhibitor （SKTI） confers resistance to the brown planthopper （Nilaparvata lugens Stal） in transgenic rice[J].Mol Breed，1999，5： 1-9.
　　[24]李桂英，許新萍，李宝健，等.水稻抗虫基因工程新进展[M].中国稻米，2004，4：12-13.
　　[25]Dong Y，Jin X，Tang Q，el al.Development and Event-specifiec detection of transgenic glyphosate-resisant rice expressing the G2-EPSPS gen[J].Front Plant SCI.，2017，8：885.
　　[26]Yang L，Yang Y，Jin W，et al.Development interlaboratories validation of event-specific real-time  PCR method for geneticaiiy modified rice G6HI event [J].J Agric Food Chem.，2018，66（30）：8179-8186.
　　[27]张大兵，郭金超.转基因生物及其产品检测技术和标准化[J].生命科学，2011，23（2）：195-204.
　　[28]魏岁军，邓力华，肖国樱.转基因水稻EB7001S事件特异性检测方法的建立[J].农业生物技术学报，2014，22（5）：621-631.
　　[29]金永梅，马瑞，于志晶，等.转基因水稻吉生粳2号的外源基因旁侧序列分离及事件特异性PCR检测方法[J].东北农业科学，2016，41（1）：14-19.
　　[30]Clark M.S[英]，主编.顾红雅，瞿礼嘉，主译.植物分子生物学[M].北京：高等教育出版社，1998：21-41.
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