甘肃省陇东南大豆孢囊线虫的发生和分布

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　　摘要 为了解甘肃省陇东南地区大豆孢囊线虫病分布和发生程度，采用Z字形取样法，对甘肃省陇东南地区9个县（区）37个乡镇大豆孢囊线虫病的发生和分布进行调查，并根据形态特征和rDNAITS序列比对鉴定线虫种类。共采集土样411份，陇东地区大豆孢囊线虫检出率为87.2%，其中镇原、西峰、正宁、华池和环县的检出率最高，达100%，镇原孢囊发生量最大，平均孢囊数为11.4个/100 g土;陇南地区大豆孢囊线虫检出率为63.7%，成县和徽县分别为64.0%、63.0%，平均孢囊数分别为0.9和1.2个/100 g土。经形态学特征观测和rDNAITS序列比对，甘肃省陇东南采集到的孢囊线虫均鉴定为大豆孢囊线虫Heterodera glycines。
　　关键词 大豆孢囊线虫病; 分布; 发生; 鉴定
　　中图分类号： S 432.45
　　文献标识码： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018253
　　Abstract In order to understand the occurrence and distribution of soybean cyst nematode in southeast of Gansu Province， zigzag sampling method was used to investigate soybean cyst nematodes in 37 townships of 9 counties in southeastern Gansu. The species of nematodes were identified based on the morphological observation and rDNAITS sequence analysis. Totally， 411 samples of soil samples were collected. The results showed that the detection rate of soybean cyst nematodes in eastern Gansu was 87.2%， among which the detection rates in Zhenyuan， Xifeng， Zhengning， Huachi and Huan County were the highest， with the rates of 100%， while that in Qingcheng was the lowest by 39.3%. The highest density was found in Zhenyuan with the average cysts number of 11.4 per 100 g soil. The detection rate of soybean cyst nematodes in southern Gansu was 63.7% and those in Chengxian and Huixian were 64.0% and 63.0%， respectively， and average densities of nematodes were 0.9 and 1.2 per 100 g soil， respectively. Morphological observation and rDNAITS sequence analysis showed that the cyst nematodes collected in southeastern Gansu were identified as Heterodera glycines.
　　Key words soybean cyst nematode disease; distribution; occurrence; identification
　　大豆孢囊線虫Heterodera glycines是豆类生产上的重要线虫，在世界各主要大豆产区均有发生[1]。1899年俄国人雅切夫斯基等在我国黑龙江省西部首次发现大豆孢囊线虫病，随后巴西、日本、韩国、朝鲜、美国、加拿大、哥伦比亚、印度尼西亚、俄罗斯、埃及等国家相继报道了大豆孢囊线虫的发生[24]。目前，我国黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、北京、河南、河北、山东、山西、安徽、江苏、湖北、浙江、上海、新疆、陕西、宁夏和甘肃等地已证实有大豆孢囊线虫分布[58]。该病一般造成大豆减产5%～10%，严重时减产达30%～50%，甚至绝产[5，910]，严重制约豆类作物生产安全。
　　近年来，随着大豆孢囊线虫在各地严重发生，贵州、山东、河北、新疆及黑龙江等地对大豆孢囊线虫开展了较系统的研究，但甘肃省相关研究的报道较少。叶文兴等[11]，Peng等[12]报道在甘肃省发现大豆孢囊线虫，但有关其发生情况和危害程度尚缺乏了解。
　　甘肃省种植大豆区域广、历史久，陇东南是甘肃省大豆主产区，以种植春播大豆为主，多数地区小麦、玉米、大豆进行轮作，少数夏播大豆是在小麦和油菜收获后复种。目前，大豆孢囊线虫在甘肃省的分布、发生以及危害情况尚不清楚，一旦大面积发生，将严重影响甘肃地区大豆的安全生产。本研究拟对甘肃陇东南地区大豆孢囊线虫开展调查研究，以期明确大豆孢囊线虫病在该地区的分布、发生程度，并对病原线虫种类进行鉴定，为该病害的及时有效防治提供依据。
　　1.2 孢囊的分离和计数
　　参照李惠霞等[13]的试验方法，随机取100 g风干后土样倒入塑料桶内，加入自来水搅拌使其泥浆均匀，静置2～3 min，将上层的悬浮液依次倒入26目和60目的筛网过滤，重复3～4次。冲洗26目筛网上的残留物，使孢囊和细渣全部冲入60目筛网中，用小水流从正面轻轻淋洗60目筛。冲洗干净后，用洗气瓶冲洗60目网筛上的剩余物质至尼龙纱上，编号，在解剖镜下检查尼龙纱上的孢囊并计数，统计孢囊检出率。 　　孢囊检出率=检测出孢囊的土样数/总土样数×100%。
　　1.3 孢囊线虫的形态学鉴定
　　从各群体中挑选饱满孢囊，参照冯志新[14]的方法在体视显微镜下用锋利的解剖刀切下阴门锥，用牙签或者昆虫针轻轻清除阴门锥内侧附着物，转移到40% H2O2中漂白处理4 min。依次转移至70%、95%、100% 乙醇中脱水，制作成临时玻片。参照王明祖等[15]的方法鉴定孢囊线虫的种类。
　　1.4 孢囊线虫DNA的提取
　　参照彭德良等[16]的方法提取线虫DNA。挑取1个饱满孢囊，放入装有14 μL灭菌重蒸水的Eppendorf管中，加入3 μL10×PCR buffer（含Mg2+）和3 μL蛋白酶K，在液氮中速冻1 min。用乙醇消毒的玻璃棒快速研磨1～2 min。-20℃冷冻2 h，然后将Eppendorf管在65℃下温育1.5 h，95℃处理10 min，使蛋白酶K变性，离心1 min，取上清DNA悬浮液放入-20℃保存，备用。
　　1.5 不同地区大豆孢囊线虫群体的rDNAITS扩增及测序分析
　　采用25 μL的PCR扩增体系[17]：模板DNA 2 μL、通用引物TW81（5′GTTTCCGTAGGTGAACCTGC3′）和AB28（5′ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT3′）各1 μL、10×PCR buffer（含Mg2+）2.5 μL、dNTPs 1 μL、Taq DNA聚合酶0.2 μL，ddH2O补足到25 μL。扩增条件：94℃预变性4 min;94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，循环35次;72℃延伸10 min，扩增产物-20℃保存。取5 μL扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，100 V，30 min，电泳后在紫外灯下观测、照相。将扩增产物送上海生工生物技术有限公司进行纯化测序，进行亲缘关系分析。
　　2 结果与分析
　　2.1 甘肃陇东南大豆孢囊线虫的分布
　　本试验采集了甘肃陇东南9个县（区）37个乡镇的411份土壤样品，调查结果表明，295份土壤样品含有孢囊线虫，孢囊检出率为71.8%（表2）。所調查的9县均有孢囊线虫分布，其中镇原、西峰、正宁、华池及环县的检出率最高，达100%。宁县、徽县、成县的孢囊检出率分别达到98.2%、63%、64%，检出率最低的是庆城，为39.3%（表2）。
　　2.2 甘肃陇东南孢囊线虫发生程度
　　由表3可知，甘肃陇东南调查的9个县（区）均有大豆孢囊线虫发生，不同地区大豆孢囊线虫密度差别较大，同一地区大豆田的孢囊线虫发生程度也存在差异。平均孢囊数为5.9个/100 g土。镇原和宁县孢囊线虫发生程度最为严重，每100 g土样平均孢囊数分别为11.4个和10.7个，个别地块土样孢囊数超过20个;陇南地区的成县和徽县孢囊线虫发生程度最轻，每100 g土样平均孢囊数分别为1.2个和0.9个，且35%以上的土样无孢囊检出，60%以上土样每100 g土中平均孢囊数在1～5个之间（表3）。
　　2.3 孢囊线虫的形态学鉴定
　　孢囊呈梨形或柠檬形，颜色浅褐色至深褐色（图1a），长度为663.1 μm（547.0～752.1 μm）;宽度为457.5 μm（343.3～565.0 μm）;阴门锥下方有较多明显的长形泡状突，具有双半膜孔，两膜孔间有发育良好的下桥（图1b），阴门膜孔长度41.4 μm（38.8～43.3 μm）;膜孔宽度40.3 μm（39.3～41.1 μm）;阴门裂长42.4 μm（36.3～47.8 μm）;下桥长89.3 μm（82.1～101.8 μm）。本试验研究结果与刘维志等[6]的测量结果基本一致，将其初步鉴定为大豆孢囊线虫H.glycines。
　　2.4 不同地区大豆孢囊线虫群体rDNAITS序列分析
　　对甘肃省陇东南采集的孢囊线虫群体的rDNAITS进行PCR扩增，均扩增出约1 000 bp的DNA片段（图2）。选择具有代表性群体在GenBank中进行同源性比对分析，结果表明采自陇东西坡（GsXp，MH371304）、玄马（GsXm，MH371375）、洪得（GsHd，MH371378）、焦作（GsJz，MH375356）、肖金（GsXj，MH375357）、上肖（GsSx，MH375358）、陇南抛沙（GsPs，MH375376）的孢囊线虫群体rDNAITS序列与来自美国的大豆孢囊线虫群体（Clone3460）ITS序列（KY794755）相似度达99%;而陇东焦作、陇南抛沙两个群体的rDNAITS序列与来自我国山东的大豆孢囊线虫群体（YS1）ITS序列（JQ068764）、伊朗大豆孢囊线虫群体（Did38）ITS序列（JX024210）相似性达100%。综上，根据形态观察和ITS序列分析，确定甘肃省陇东南地区寄生在大豆上的孢囊线虫均为大豆孢囊线虫H.glycines。
　　3 讨论
　　大豆孢囊线虫属于孢囊线虫属Heterodera，是一种土传的定居性内寄生线虫，也是具有毁灭性危害的植物线虫。大豆孢囊线虫可在显微镜下通过观察孢囊形态进行鉴别，成熟的孢囊为柠檬形或梨形，浅褐色至深褐色，颈部和尾部有明显突出，阴门锥双半膜孔，阴门裂较长，两膜孔间的下桥明显[18]。本试验采集的孢囊线虫经形态学鉴定和rDNAITS序列分析表明均是大豆孢囊线虫，与叶文兴等[12]的鉴定结果一致。
　　大豆孢囊线虫可通过跨区作业的收割器械，水流及沙尘暴等传播。甘肃与青海、陕西、宁夏和新疆四省相邻，而新疆、陕西和宁夏均发现大豆孢囊线虫病[19]。2003年，张俊立等[20]在河北省采集大豆根际土壤样品65份，大豆孢囊线虫检出率高达73.93%。宋美静等[21]对全国20个省（自治区）的大豆孢囊线虫进行调查，结果总检出率达69.4%，其中东北和黄淮海地区发生率最高，沧州、长春和黑河地区检出率高达100%。黑龙江省35个地区大豆孢囊线虫的发生率高达100%，每年造成的损失高达数十亿元[22]。龙海波等[23]对贵州省大豆孢囊线虫的发生和危害进行调查，结果表明总检出率仅为28.2%，但大方县和赫章县发生严重，检出率超过40%。本试验表明，甘肃省大豆主产地区大豆孢囊线虫的发生较普遍，陇东地区大豆孢囊线虫的检出率为87.2%，陇南地区大豆孢囊线虫的检出率为63.7%。在本试验中，庆阳地区大豆孢囊检出率高于陇南，可能是由于陇南降雨量远大于庆阳，而大豆孢囊最适宜孵化的土壤含水量为10%～25%[24]，土壤含水量过高会抑制孢囊线虫的繁殖;陇南地区长期实施小麦、马铃薯、玉米和大豆轮作种植，也是导致大豆孢囊线虫发生率低的原因。 　　大豆是甘肃陇东南地区主要经济作物，目前甘肃省种植面积保持在13.33万～15.33万hm2，陇东地区面积最大，达到10万hm2[25]。本研究表明，陇东地区检出率为87.2%，由此可推算出仅陇东地区大豆孢囊线虫病的发生面积约为8.7万hm2。甘肃省地处黄土、青藏和蒙古三大高原交汇地带，气候类型多样，且位于黄河上游，沙尘和黄河灌溉水加剧了大豆孢囊线虫的传播和蔓延。陇南地区气候温和，属东亚季风气候;陇东地区属半干旱区，年均降水量500 mm，是典型大陆性气候，适宜大豆孢囊线虫病发生。
　　大豆孢囊线虫病是一种积年流行病害，且病情逐年加重。在实际生产中种植抗耐病品种轮作、喷施化学药剂及生物防治等措施均对大豆孢囊线虫病有一定的防治作用[26]，但这些措施都存在局限性，轮作周期长，在有限的耕地资源内不易实现，生物防治在大田中不稳定，易受环境影响，常用杀线剂成本较高且污染环境，农户难以接受。大豆孢囊线虫理论上存在16个生理小种[27]，连续种植抗病品种会改变生理小种，导致育种的难度增加。因此，应进一步研究甘肃省大豆孢囊线虫的侵染规律、生理小种类型，探明该病害防治关键期，通过田间试验筛选出生防制剂和高效低毒的杀线剂，为今后甘肃省大豆孢囊线虫的防治奠定基础。
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