头花杜鹃挥发油的化学成分分析及其对3种仓储害虫的毒杀作用

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　　摘要 本研究旨在明确头花杜鹃挥发油的化学成分及其对烟草甲、赤拟谷盗和嗜卷书虱的毒杀作用。利用GC/MS分析了头花杜鹃叶挥发油的化学组分;通过触杀和驱避试验测试头花杜鹃叶挥发油的生物活性。结果表明：从头花杜鹃叶挥发油中鉴定出的成分共有30种，占总成分的100.00%，其主要成分为：α蒎烯（25.32%）、β蒎烯（19.90%）和6，8吡啶并[3，4d]嘧啶4（3H）酮酸盐（7.45%）;头花杜鹃叶挥发油对烟草甲、赤拟谷盗和嗜卷书虱的LD50分别为44.40、104.92 μg/头和98.87 μg/cm2;在测试2 h和4 h后其对赤拟谷盗和嗜卷书虱的驱避效果与阳性对照除虫菊素产生的效果一致。上述结果表明，头花杜鹃叶挥发油对烟草甲、赤拟谷盗和嗜卷书虱均具有较好的毒杀作用，这可能与头花杜鹃叶挥发油中的主要成分α蒎烯有关。
　　关键词 头花杜鹃; 烟草甲; 赤拟谷盗; 嗜卷书虱
　　中图分类号： S 482.39
　　文献标识码： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2018206
　　Abstract This study focused on analyzing the chemical composition of the essential oils from Rhododendron capitatum Maxim. and examining the toxic activities of the oils against Lasioderma serricorne， Tribolium castaneum and Liposcelis bostrychophila. The activities of the oils were tested via contact toxicity and repellent activity assays， and its chemical components were analyzed by GCMS. Thirty components from the essential oils extracted from R.capitatum were identified and the sum of their contents accounted for 100.00% of the essential oil; the major components were αpinene （25.32%）， βpinene （19.90%） and pyrido [3，4d] pyrimidine4（3H）one， 6，8dimethyl （7.45%）. The essential oils exhibited potential contact toxicity against L.serricorne （LD50=44.40 μg/adult）， T.castaneum （LD50=104.92 μg/adult） and L.bostrychophila （LD50=98.87 μg/cm2）， and its repellent activity against T.castaneum and L.bostrychophila， was consistent with that of the positive control DEET.R.capitatum essential oils had significant toxic activities against 3 kinds of storage pests， which might be related to the main component αpinene in the essential oils.
　　Key words Rhododendron capitatum; Lasioderma serricorne; Tribolium castaneum; Liposcelis bostrychophila
　　頭花杜鹃Rhododendron capitatum Maxim.为杜鹃花科杜鹃花属常绿灌木， 是我国西北地区杜鹃花属植物中产量较高的一个品种， 主要分布在青海、甘肃和四川等省，资源丰富[1]。目前关于头花杜鹃的研究主要集中在其挥发油化学成分分析以及药理作用等方面，李国贤等[2]发现头花杜鹃挥发油显著的祛痰和镇咳作用与其主要成分α蒎烯有关，且其毒性较低，吕义长等[3]发现头花杜鹃挥发油含氧部分对呼吸道常见菌种如流感杆菌、肺炎球菌等有明显抑制作用，许子俊等[4]证明从头花杜鹃的水提物中分离到总黄酮降血压作用明显，但头花杜鹃对仓储害虫生物活性的研究尚未见报道。
　　烟草甲Lasioderma serricorne、赤拟谷盗Tribolium castaneum和嗜卷书虱Liposcelis bostrychophila均是广泛存在于储藏物中的昆虫，现已成为我国大型粮仓中的优势害虫种群。早前仓储害虫的防治措施以磷化氢（磷化铝）熏蒸最为普遍，但长期使用会对环境和人类健康造成一定影响，近年来，植物源防护剂因其具有高度选择性，易于分解和对人畜安全性高等优点而逐渐代替了化学防护剂[510]。
　　田雨浓[11]的研究表明，α蒎烯能抑制大麦虫Zophobas morio幼虫体内羧酸酯酶（CarE）活性，因此幼虫体内的解毒作用被抑制，导致幼虫本身生理机能下降，致使幼虫死亡。在此背景下，本文结合含有α蒎烯的头花杜鹃挥发油较强的抑菌活性以及α蒎烯本身具有的杀虫活性，测定头花杜鹃挥发油对烟草甲、赤拟谷盗和嗜卷书虱这3种仓储害虫的触杀和驱避作用，以探讨其对仓储害虫的生物活性，为头花杜鹃挥发油杀虫活性的研究以及头花杜鹃资源的开发利用提供参考依据。 　　1 材料和方法
　　1.1 材料与仪器
　　头花杜鹃的嫩枝叶采自甘肃省天祝县石门镇，海拔2 765 m，经纬度36°58′58″N，102°54′04″E。头花杜鹃样本保存于西北师范大学生命科学学院实验室。
　　烟草甲、赤拟谷盗和嗜卷书虱均饲养在容积为0.5 L、温度为（28±1）℃、相对湿度为70%～80%的玻璃瓶中。培养烟草甲和赤拟谷盗的玻璃瓶内装有以10∶1质量比混合的小麦粉与酵母粉，嗜卷书虱瓶内装有奶粉、活性酵母及面粉，并以1∶1∶1质量比混合。试验所用昆虫均为已生活1～2周的成虫，且培养昆虫的所有容器及试验中所用的培养皿封口处都涂有聚四氟乙烯以防昆虫逃逸。
　　正己烷、无水硫酸钠等试剂购自上海安谱科学仪器有限公司。试验所用仪器包括自制挥发油提取器、7980/5975CGC/MSD气相色谱质谱联用仪（美国Agilent公司生产）、GHP9080隔水式恒温培养箱（常州中捷实验仪器制造有限公司生产）。
　　1.2 方法
　　1.2.1 挥发油的提取
　　将头花杜鹃的新鲜叶片阴干后切碎，取500 g转移进挥发油提取器中进行提取，时间为6 h。油水经正己烷溶剂萃取，无水硫酸钠处理后过滤，即得头花杜鹃叶挥发油。挥发油放密封容器中并于4℃冰箱保存。
　　1.2.2 GC/MS分析
　　参照姚晶等[12]的方法测定头花杜鹃叶挥发油的化学组分。
　　1.2.2.1 色谱条件
　　色谱柱HP5MS型弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;设定程序升温;载气为He;载气流速为1.0 mL/min;汽化室温度为220℃;进样量为0.4 μL，;分流比为20∶1。杜鹃花科杜鹃花属植物程序升温条件：初温40℃，保持2 min，以6℃/min升至80℃，保持1 min，再以5℃/min升至160℃，保持1 min，最后以10℃/min升至290℃，保持6 min。
　　1.2.2.2 质谱条件
　　电离方式为EI;电子能量为70 eV;离子源温度为230℃;四级杆温度为150℃;数据采集模式为全扫描;质谱扫描质量范围为50～500 mAu。经计算机检索质谱数据库（NIST 05和Wiley 275 libraries）数据，比对各峰的 MS碎片并结合有关文献谱图解析，鉴定挥发油各组分种类。采用峰面积归一化法，根据各组分分子质量，计算挥发油中各组分的相对百分含量（质量分数）。
　　1.2.3 生物活性测定
　　1.2.3.1 触杀活性测定
　　头花杜鹃叶挥发油对烟草甲、赤拟谷盗和嗜卷书虱的触杀活性测定参照文献[1315]。将羽化7 d左右的成虫从培养皿中取出用冰袋麻醉，取头花杜鹃叶挥发油溶解于正己烷中进行预试验（浓度范围为2%～50%）。根據预试验结果设置正式试验的5个浓度梯度（烟草甲的测试浓度为3.95%、5.92%、8.88%、13.3%和20%，赤拟谷盗的测试浓度为14.47%、17.36%、20.8%、25%和30%，嗜卷书虱的测试浓度为1.21%、1.01%、0.84%、0.70%和0.58%），每个浓度重复5次，每个重复10头试虫。取0.5 μL样品分别滴于烟草甲和赤拟谷盗的前胸背板上，处理后放入直径2 cm、高1 cm的培养瓶中，拧紧瓶盖;另取300 μL样品均匀涂布在直径5.5 cm的滤纸上，再用固体胶处理后放入内径为5.5 cm的培养皿中，并将嗜卷书虱放在滤纸上，盖上盖子。在相同操作条件下，以正己烷和除虫菊素代替头花杜鹃叶挥发油处理试虫分别作为阴性对照和阳性对照（相关研究表明，除虫菊素对仓储害虫的毒杀作用极强[1617]）。处理后置于温度（28±1）℃，相对湿度为70%～80%的恒温培养箱中培养24 h，观察记录死亡情况。采用SPSS 22.0统计软件分析计算半致死剂量LD50。
　　1.2.3.2 驱避活性测定
　　头花杜鹃挥发油对烟草甲和赤拟谷盗的驱避活性测定参照文献[1315]，对嗜卷书虱的驱避活性测定参照文献[18]。将头花杜鹃挥发油用正己烷稀释成5个浓度的溶液（烟草甲和赤拟谷盗的测试浓度为78.63、15.73、3.15、0.63和0.13 nL/cm2，嗜卷书虱的测试浓度为63.16、12.64、2.52、0.50和0.10 nL/cm2）。将直径9 cm的滤纸剪成相同的两半，一半均匀地滴入0.5 mL不同浓度的头花杜鹃挥发油，另一半滴入等剂量的正己烷作空白对照，待正己烷完全挥发干后，立即用固体胶将处理过的滤纸相向紧粘在培养皿底部，再将20头试虫（烟草甲和赤拟谷盗）从培养皿中央投入，迅速盖上培养皿盖子密封;嗜卷书虱的驱避试验与之相似，不同的是所用滤纸和培养皿直径均为6 cm，且改用150 μL样品溶液处理滤纸。每浓度处理5个平行样。同时在同等操作条件下，以除虫菊素作为阳性对照组。将各处理温室放置，分别于处理2 h和4 h后统计出现在不同区域内的试虫数量。计算驱避率（PR）[14]。
　　PR=（Nc-Nt）/（Nc+Nt）×100%
　　式中，Nc为出现在阴性对照区域的试虫数量，Nt为出现在试验组区域的试虫数量，从而计算出PR的平均值。
　　2 结果与分析
　　2.1 头花杜鹃挥发油的化学成分分析
　　GC/MS总离子流色谱见图1，经计算机检索NIST数据库，比对各峰的MS碎片并结合有关文献谱图解析，从头花杜鹃挥发油中分离鉴定出30种化合物，它们的含量之和占全部的100.00%，结果见表1。
　　结合图1和表1可知，从头花杜鹃挥发油中共鉴定出30种化学成分，占总挥发油的100.00%，其中主要成分为α蒎烯（25.32%）、β蒎烯（19.90%）和6，8二甲基吡啶[3，4d]嘧啶4（3H）酮（7.45%）。 　　2.2 生物活性
　　2.2.1 触杀活性
　　头花杜鹃叶挥发油对烟草甲、赤拟谷盗和嗜卷书虱触杀毒性的相关数据见表2。
　　3 结论与讨论
　　有文献报道，青海省东沟煤矿产头花杜鹃挥发油的主要成分为α蒎烯（52.7%）和β蒎烯（25.6%）[1]。青海互助北山林场产头花杜鹃挥发油的主要成分为β蒎烯（29.02%）、α蒎烯（28.31%）和柠檬烯（7.45%）[12]与本研究所得的结果不同。根据杨扬[19]的研究结果，这种差异可能是因其产地（生态环境）、生长年限、采样时间和分离手段等不同所致。
　　与其他文献中运用类似生物测定方法的挥发油相比，头花杜鹃叶挥发油对烟草甲的触杀毒性弱于高良姜挥发油（LD50=26.12 μg/头）[20]，但强于侧柏叶挥发油（LD50=50.45 μg/头）[21];对赤拟谷盗的触杀毒性弱于珠光香青挥发油（LD50为41.25 μg/头）[14]和艳山姜叶挥发油（LD50=48.59 μg/头）[22];对嗜卷书虱的触杀毒性弱于短葶山麦冬挥发油（LD50为21.37 μg/头）[15]和北苍术挥发油（LD50=19.98 μg/头）[23]。
　　头花杜鹃叶挥发油主要成分为一萜烯和倍半萜烯类，相关研究表明萜类化合物是杜鹃花科植物挥发油的主要成分，且大多被认为是一种神经毒剂，通过干扰昆虫神经系统的刺激传导，引起神经通路阻塞，进而造成神经传导物质——乙酰胆碱的积累，从而导致昆虫麻痹，并最终死亡[2426]。而田雨浓[11]认为α蒎烯能明显抑制大麦虫幼虫体内羧酸酯酶以及乙酰胆碱酯酶的活性，因此幼虫体内的解毒作用被抑制，导致了幼虫的生理机能下降，致使幼虫死亡。头花杜鹃叶挥发油对烟草甲、赤拟谷盗和嗜卷书虱的毒杀作用也许与其主要成分α蒎烯有关，其通过影响仓储害虫体内主要的保护酶、解毒酶以及乙酰胆碱酯酶的活性，从而扰乱害虫体内正常的生理代谢，进而对上述三种仓储害虫表现出较高的毒杀效果。本文主要针对头花杜鹃挥发油进行了生物活性测试，其具体杀虫机理尚有待进一步探究。
　　虽然头花杜鹃叶挥发油对烟草甲、赤拟谷盗和嗜卷书虱的触杀活性低于除虫菊素，但其具有低毒、环保的优点，同时头花杜鹃叶挥发油对赤拟谷盗和嗜卷书虱的驱避活性与除虫菊素很相似，因此将头花杜鹃叶挥发油开发为新型绿色环保植物源杀虫剂，并运用于这三种仓储害虫具有一定意义。自然界中的植物资源非常丰富，这为研究并开发新的植物源杀虫剂提供了坚实基础。目前，国内外虽然对植物源杀虫剂在害虫防治中的应用有了很多的研究，但市场开发少，仍需要深入研究。
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　　（责任编辑：田 喆）
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