DNA条形码技术在昆虫分类学中的研究进展

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　　摘要：DNA条形编码（DNAbarcoding）是一种快速、准确的生物分类技术，它是分子生物学和生物信息学相结合的产物。昆虫种类繁多，近似物种鉴定困难使该技术在昆虫分类工作中得到了广泛应用。文章简要综述了DNA条形码技术的概念、原理与操作步骤，详细阐述了DNA条形码技术在昆虫分类研究中的具体应用情况，对其在应用过程中相比传统形态分类方法的优势和存在问题予以论述，并探讨了DNA条形码技术今后在昆虫分类中应用的可行性与发展前景。
　　关键词：DNA条形码;昆虫分类学;研究进展
　　中图分类号：Q969  文献标志码：A  论文编号：cjas18050009
　　0引言
　　DNA条形码技术（DNA Barcoding）由分类学家Paul Hebert在21世纪初首次提出[1-2]，作为分类学中一项辅助技术，它代表了一个新的发展方向[3]，该技术的提出引起了越来越多生物学家的关注。在昆虫分类学发展史中，DNA条形码是自林奈双名法以来最为突出的变革，不仅促进了昆虫分类学和物种多样性研究进程的发展，而且对种群生态学、物种遗传学和个体分子系统发育等交叉学科的研究也起到积极的助推作用[4-5]。
　　1  DNA条形码概念
　　生命DNA条形码协会将DNA条形码定义为可以实现精准鉴定物种的一小段DNA标准序列。该技术通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分析，利用线粒体细胞色素C氧化酶亚单位I（CO I）的特定标准区域做模板进行物种鉴定。概括地讲，DNA条形码核心技术是对已知的目标基因片段进行大范围的扫描验证，进而最终确定某个未知的物种或者发现新种[1-2，6]。
　　2  DNA条形码技术原理及操作过程
　　2.1  DNA条形码技术应用原理
　　应用DNA条形码的3个基本条件：（1）能够得到待定物种的DNA特定序列，即被鉴定物种的DNA标准区域;（2）目标DNA序列信息容易进行鉴别分析;（3）目标DNA序列位点信息可以成功鉴定分析相似物种[7-10]。如同商品零售业使用的条形编码，各物种的DNA序列都具备唯一性。在DNA序列的组成上，每个位点都有4种碱基可供选择，尽管由于自然选择的因素，个别位点上的碱基是固定的，会导致编码组合数减少，此现象可通过针对相关蛋白编码基因予以解决。由于在蛋白编码基因里密码子的简并性，其中第3位碱基通常不受自然选择的影响，而且物种间的遗传差异远远超过种内变异[1-2]，可采用基于CO I基因序列的DNA条形码作为疑似昆虫物种鉴定的有效手段。
　　2.2  DNA条形码技术操作过程
　　通过PCR扩增和测序技术，对源自不同生物个体的同源DNA特定片段序列进行测序，然后对得到的DNA序列进行多重序列比对和聚类分析，从而将待定物种准确定位到一个己描述过的分类种群中。对某些物种来说，甚至可将其分布准确到特定的地理种群[11]，具体包括以下几个操作步骤[12-13]：（1）样品的采集与预处理，（2）提取样本DNA，（3）DNA条形码标准目的基因的扩增，（4）PCR产物的纯化、序列测定以及分析。通过序列分析将所有序列进行双重比对并计算其差异值，根据差异值即可确定物种之间的近源关系。
　　3  DNA条形码技术在昆虫分类学中的应用
　　DNA条形码在昆虫分类中的应用技术是建立在传统形态分类学和现代分子技术基础上的交叉学科应用范畴，体现在先通过传统分类手段对物种个体有效特征进行形态上的识别和描述，而后随着分子技术的应用，个体特征识别又得以补充和完善[14]。Tautz等[15]最先提出把DNA序列作为主要平台应用于生物物种分类系统中，即DNA分类学（DNA Taxonomy）建立的雏形。Hebert等[1-2]最先提出利用线粒体细胞色素C氧化酶I亚基（mtCO I）这一特定基因区段作为DNA条形编码的基础，对除刺胞动物门以外所有的动物界门，包括11个门13320个物种的CO I基因序列进行分析，发现此特定基因区段差异能够很好地对被研究物种加以区分识别，故认为mtCO I是动物界中较为合适的DNA条形码标准基因。昆虫种类繁多，近似物种鉴定困难，DNA条形码技术在昆虫分类中已得到广泛应用，截至2018年5月，BOLD数据库已经有超过400万涉及昆虫的条形码记录，超过整个动物界的70%以上，包括了183513个具体物种，其中已公开的有137048种（http：//www.barcodinglife.org）。DNA条形码技术在分类研究中，最先在鳞翅目昆虫中得到应用，Hebert等[1]选取CO I基因的一段序列对200多个鳞翅目昆虫种类进行识别，鉴定结果认为CO I基因的特定序列可以成功鉴定每个昆虫個体。随后，Hebert等[16]又对2500多只哥斯达黎加普通蝴蝶（Astraptes fulgerator）进行研究，结果发现这些蝴蝶的DNA条形编码清楚地进入10个不同的组中，表明该复合体至少有10个隐存种，而在此之前这些蝴蝶被简单地归为一种，所以说单靠形态学特征不能对这些蝴蝶进行区分，也进一步证明DNA条形码对发现隐存分类单元有极大帮助。Brown等[17]结合形态分类学和DNA条形编码技术，报道了巴布亚新几内亚的鱗翅目新种Xenothictis gnetivora。Hajibabaei等[13]应用DNA条形码技术对源自热带区域的多种鳞翅目昆虫进行了识别。半翅目昆虫中蚜虫类应用较多，蚜虫类昆虫有超过4400种，而且转主危害也增加了分类工作的难度。Favret和Voegtlin[18]用小片段CO I基因序列鉴定形态学上难以鉴别的五节根蚜族蚜虫的次生寄主型，结果表明这些不同寄主型也能被准确识别鉴定。Foottit等[19]研究认为DNA条形编码可以对寄居在不同宿主、不同生活周期的蚜虫进行有效的物种鉴定，并且还揭示了蚜虫的多样性与蚜虫生命周期具有一定相关性。烟粉虱是一种世界范围灾害性害虫，各国纷纷对烟粉虱的生物型以及系统发育进行深入研究，研究证实，基于线粒体细胞色素氧化酶I（mtCO I）基因的差异能有效反映烟粉虱生物型的地理模式[20-22]。另外，DNA条形码技术在等翅目、弹尾目等昆虫分类中均有应用[23-24]。Ball和Hebert[25]应用630 bp CO I基因序列对蜉蝣目昆虫进行研究，结果显示种内和种间序列平均差异分别为1%和18%，证明DNA条形码可以有效区分蜉蝣目昆虫。在鞘翅目方面，Monaghan等[26]在对马达加斯加热带水生甲虫的研究中，应用DNA序列在鉴定已记述种的同时发现了几个隐存种。 　　随着国际上DNA条形码技术在昆虫分类中的广泛应用，国内分类学者也开始关注该技术，肖金花等[3]、王鑫等[27]、王剑峰等[28]、李青青等[29]、池宇等[30]、张媛等[31]分别对DNA条形码技术及其在相关学科中的应用进行了综述。诸立新等[32]基于CO I基因约640 bp片段序列的遗传距离分析，对尾凤蝶属（Bhutanitis）4种蝴蝶的20个标本进行了鉴定。潘程莹等[33]以7种常见的斑腿蝗科（Catantopidae）蝗虫为对象测定了CO I基因序列，探讨了CO I基因作为DNA条形码在鉴别蝗虫物种的可行性。游中华等[34]通过应用CO I基因，对生物入侵种西花蓟马（Frankliniella occidentalis）及其他8种常见蓟马进行了鉴定。李敏等[35]通过扩增中国普缘蝽属（Plinachtus）4个已知种的CO I（1338 bp）序列，计算了种间/种内的遗传距离。罗晨等[36]利用mtDNACO I基因序列鉴定了国内烟粉虱（Bemisia tabac）的生物型，结果发现5个烟粉虱实验种群的生物型与Texas-B型和Arizona-B型种群为同一生物型“B”。褚栋等[37]利用CO I基因片段对国内外12个地理种群烟粉虱的生物型进行了鉴定，并对地理种群来源进行分析，结果发现中国主要省市发生的烟粉虱与国外的B型烟粉虱具有99.8%?100%的同源性，从而确定了在中国大多数地区暴发成灾的烟粉虱生物型为“B”型。截至2013年8月，BOLD数据库已有烟粉虱标本记录1557个，DNA条形码记录1427个，其中CO I>500 bp的记录有945个。杨立等[38]通过对隶属3科10属12种的嗜尸性苍蝇线粒体DNA上细胞色素氧化酶亚单位I（mtCO I）中278 bp基因序列进行检测，证实了mtDNA上CO I中278 bp基因序列能准确地对嗜尸性苍蝇进行种类鉴定。范京安等[39]选用双翅目实蝇科（Tephritidae）12属36种55个样本为材料，将其DNA条形码（648 bp）与微型DNA条形码（50?200 bp）数据进行比较分析，探讨微型DNA条形码对果实蝇物种鉴定的可行性，虚拟实验结果显示微型DNA条形码与DNA条形码鉴定结果一致，两者均可作为实蝇物种鉴定的可靠依据。
　　4  DNA条形码技术在应用中的优点及存在问题
　　与传统形态鉴定方法相比，DNA条形码技术具有以下优点：（1）准确性高，亲缘较近的不同物种外形极其相似，而形态鉴别容易导致鉴定误差，利用碱基序列通过数字化进行物种鉴别，能够准确区分相似物种;（2）快速迅捷，目前世界上已定名的昆虫仅占一小部分，今后分类学家可参考DNA条形码数据库来鉴别或发现新种，使大量繁琐的鉴定工作变得更加快捷;（3）非专业鉴定，由于该技术是一套机械程序，即使无分类学专业知识的研究人员也可以准确地进行物种辨认;（4）适用昆虫的不同生长阶段，相比需要成虫为对象的传统鉴定方法扩大了样本范围;（5）不需要特定的组织材料，因为同一个体或同种昆虫不同个体的同源DNA序列是高度一致的[40]。
　　尽管DNA条形码技术具有上述优势，但单一位点特定序列鉴定的特点使其略显不足，依目前的技术手段还不能完全取代传统形态分类地位。一个新物种的命名和描述不是仅提供一个条形码就可以完成，对于地球上节肢动物的多样性，除了依赖DNA条形码，对于昆虫的寄主类型、危害特征、形态描述、地理分布以及行为特征的描述都是非常必要的。其存在问题表现在以下方面：（1）需根据目标产物的大小设计相应PCR条件，研究者应对条形码使用的基因区域足够了解[41]，而且应分层次（属、种等）寻找适合的条形码[4];（2）不同物种间线粒体基因水平转移、近缘物种共享线粒体表现出的多态性都会给鉴定增加困难，同属物种间的差异不显著以及DNA序列突变也给物种鉴定工作带来困扰;（3）对物种进行地理种群和系统发育学分析时经常会得到结论有时会与形态学研究结果有所偏差，如何界定物种分化水平一直是动物分类学家争论的焦点，鉴于物种的界定在一定程度上受人为影响，线粒体DNA在生物系统地理学研究中的局限性将是今后研究人员面临的关键问题[42];（4）参与研究单位少和研究领域不集中，數据共享不足;（5）利用DNA条形码代价高，要建立条形编码数据库需要获取到DNA样品，一方面破坏模式标本提取DNA在一定角度上不可取，另一方面用新模标本替代原有模式标本虽然可行，但又面临新新模标本的采集和鉴定等问题。
　　5  DNA条形码技术的研究展望
　　目前，DNA条形码技术研究方向及应用主要包括DNA提取方法和测序技术的优化、探究微型条形码鉴定技术、利用条形码信息设计相应芯片、基于条形码技术设计生产便携式鉴定分析扫描仪[43-48]，而作为精准的分类手段和工具不能局限于现行通用的分子标记，应该大胆尝试和发现一些新的有可能解决疑难问题的关键功能基因。随着此技术的快速发展，DNA条形编码对昆虫多样性研究将起到越来越重要的作用，包括种类的区别和鉴定，发现新种和隐存种，重建物种和高级阶元的系统发育关系等[49-50]。
　　全世界的昆虫可能有1000万种，而目前世界上已定名的仅有100万种，所以说在昆虫分类研究中，DNA条形码技术将有长足的发展和应用空间。而且随着测序技术的更新和大数据时代海量数据的产生，通过构建包含所有发现物种DNA信息的条形码序列数据库，DNA条形码技术鉴定成本低、速度快、结果精确，必将成为生物分类学最实效的技术手段、直接的信息资源及鉴定依据。例如在农林生态系统中针对外来入侵种的检疫，如能构建一套涉及所有有害物种的DNA条形码芯片系统，并且有从各物种及生命状态中提取DNA的相应方法，可最大限度提高鉴定准确率，并加快进出口部门对有害生物的鉴定过程，避免检疫对象的蔓延和发生危害。在传统分类学发展的基础上，系统分类学和生物技术的有机结合势必带动生命科学的多元化发展，DNA条形码技术快速准确的鉴定物种将成为昆虫分类学研究的必然趋势。 　　綜上所述，作为一种标准的物种鉴定方法，DNA条形码技术可靠、快速、简便等优势使其在生物分类学、生物多样性研究等领域具备了巨大的研究及应用潜力。随着DNA条形码技术的不断更新和完善，将形成并建立各物种便捷的标准化测序系统，进而构建DNA条形码序列数据库，为物种鉴别提供可靠的信息资源及鉴定依据。
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