复合微生物固态发酵菜籽饼粕对抗营养因子去除条件的研究

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　　摘要 以菜籽饼粕为原料，采用固态发酵法研究了单菌和混合菌发酵对菜籽饼中抗营养因子降解率的影响。通过单因素试验筛选了菜籽饼发酵去除抗营养因子的菌种及复合微生物固态发酵菜籽饼去除抗营养因子的条件。结果表明，纳豆杆菌、侧胞杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草杆菌去除抗营养因子的效果比较明显。最佳条件如下：发酵时间为5 d，发酵温度为35℃，接种量为6%，发酵pH为6.5。在此条件下，植酸、纤维素、单宁的降解率最高分别达到93.74%、36.59%和14.75%。
　　关键词 菜籽饼;植酸;纤维素;单宁;发酵
　　中图分类号 S816.6文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2020）02-0189-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.02.055
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Study on the Removal Conditions of Anti-nutrients by Rapeseed Meal with Complex Microbe by Solid Fermentation
　　GUAN Wei1，LAN Shi-le2，ZHAN Yi-shu3 et al （1.Nanyue District Market Supervision Administration of Hengyang City， Hengyang，Hunan 421900;2.College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 420128;3.Changning Animal Husbandry and Aquatic Affairs Center， Changning， Hunan 421500）
　　Abstract The effects of single microbe and mixed microbe fermentation on the degradation rate of anti-nutrients in rapeseed meal were studied by using solid fermentation method， with rapeseed meal as raw materials.Single factor experiment was used to screen out the detoxified strains for removing anti-nutritional factors and the removal conditions of anti-nutritional factors in rapeseed meal.The results showed that the optimal strains were Bacillus natto， Bacillus coagulans，Bacillus laterosporus， Bacillus coagulans andBacillus subtilis.The optimal fermentation conditions were as follows： fermentation time 5 days， fermentation temperature of 35 ℃， inoculum size of 6%，fermentation pH value of 6.5. Under these conditions， the highest degradation rate of phytic acid， cellulose and tannin was 93.74%， 36.59% and 14.75% respectively.
　　Key words Rapeseed meal;Phytic acid;Cellulose;Tannin;Fermentation
　　油菜是我國重要的油料作物，种植面积和总产量均位居世界第一。菜籽饼的营养价值与豆饼接近，氨基酸组成接近联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）推荐值，是一种优良的天然植物蛋白资源。但由于菜籽饼含有硫苷、植酸、纤维素、单宁、芥子碱等抗营养物质，因此菜籽饼用作饲料的应用受到很大限制[1-3]。笔者通过以降解限制菜粕饲用的抗营养物质——植酸、单宁、纤维素为目标，从研究室保藏的菌株中筛选出在菜籽饼粕上生长能力强、高效降解植酸、单宁、纤维素的菌株;用筛选出的菌株混合发酵菜籽饼粕，测定经发酵处理后的菜籽饼粕中各项抗营养因子的降解率[4-8]，旨在为混合菌发酵菜籽饼粕制备益生蛋白饲料提供理论依据和数据参考[9]。在菜粕发酵单因素优化条件研究的基础上， 探讨复合微生物固态发酵菜籽饼粕对抗营养因子的去除条件，探讨菜籽饼脱毒的理想发酵时间、发酵温度、发酵接种量、发酵pH，并对其工艺进行优化，以期获得最优的菜粕固态发酵工艺参数，从而为菜粕的深度开发利用提供技术支持。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 菌种和菜籽饼粕。
　　酵母菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧胞芽孢杆菌，购买于湖南农业大学生物科学技术学院微生物实验室;菜籽饼粕购买于衡阳市南岳区迎宾市场菜籽榨油坊。
　　1.1.2 主要仪器与设备。分光光度计，型号V-5000型，为上海元析仪器有限公司产品;恒温搅拌循环水箱，型号H.H-60，为常州市华普达教学仪器有限公司产品;电子天平，型号KF3102，为凯丰集团有限公司产品;恒温鼓风干燥箱，型号DHG-9070型，为上海精宏实验设备有限公司产品;恒温摇床，型号QYC 2112，为上海福玛实验设备有限公司产品。 　　1.1.3 主要试剂及培养基。
　　1.1.3.1 发酵培养基。菜籽饼粕88.7%;麦麸10%;葡萄糖 1%;磷酸二氢钾0.2%;七水硫酸镁 0.1%，固体与水的比例是1∶1。在125 ℃灭菌25 min即可。
　　1.1.3.2 PDA培养基（不加琼脂）。马铃薯20 g， 葡萄糖 2 g，水100 mL，pH自然。125 ℃下湿热灭菌25 min。
　　1.1.3.3 MRS培养基：葡萄糖2.000%，牛肉膏1.000%，蛋白胨1.000%，酵母提取物0.500%，磷酸二氢钾0.200%，三水醋酸钠0.200%，柠檬酸氢二铵0.200%，吐温-80 0.100%，七水硫酸镁0.058%，pH 6.2～6.4。125 ℃下湿热灭菌25 min。
　　1.1.3.4 牛肉膏蛋白胨培养基（不加琼脂）。牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，氯化钠 5 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.2。125 ℃下濕热灭菌25 min。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 植酸含量的测定。采用碘量法[10]测定植酸含量。
　　1.2.2 纤维素含量的测定。采用硫代硫酸钠滴定（碘量法）[11]测定纤维素含量。
　　1.2.3 单宁含量的测定。采用六氰合铁（Ⅲ）酸亚铁钾吸光光度法[12-13]测定单宁含量。
　　1.2.4 种子培养和发酵培养。
　　1.2.4.1 种子培养。将保存于斜面上的菌种接种到种子液培养基中，37 ℃、180 r/min振荡培养2 d，备用。
　　1.2.4.2 发酵培养。将接种好的种子液按6%（V/W）的接种量接入发酵培养基中，37 ℃培养5 d，50 ℃下烘干粉碎，测定抗营养因子的含量，并按以下公式计算出其降解率：降解率=发酵前的含量-发酵后的含量/发酵前的含量×100%。
　　1.2.5 菜籽饼去除抗营养因子菌种的筛选。将枯草杆菌、凝结杆菌、侧胞杆菌、酵母菌、乳酸菌、纳豆杆菌的种子液按6%接种发酵培养基中，35 ℃下培养5 d，50 ℃下烘干粉碎，测定抗营养因子的含量。
　　1.2.6 复合菌发酵条件的研究。
　　通过菜籽饼脱毒，筛选出4种菌（枯草杆菌、凝结杆菌、侧胞杆菌、纳豆杆菌）作为复合菌，发酵菜籽饼。改变菜籽饼固体发酵条件，如发酵温度、起始pH、接种量及发酵时间，考察其对抗营养因子去除的影响。
　　2 结果与分析
　　2.1 单菌固体发酵菜籽饼对植酸降解率的影响
　　在250 mL三角瓶中装入45 g菜籽饼发酵培养基，调节含水量为50%，pH 为7.0，37 ℃下静置培养6 d，每隔1 d摇动1次，50 ℃下烘干，测定植酸含量，并计算其降解率，结果如图1所示。由图1可知，用不同的微生物发酵后，菜籽饼中植酸的含量都有所降低，但降低程度各不相同。经过侧胞芽孢杆菌发酵的菜籽饼，其中植酸的降解率最高（89.22%），说明侧胞芽孢杆菌的脱毒效果最为明显。其次，枯草杆菌、纳豆杆菌、凝结杆菌的脱毒效果较为理想，降解率分别为74.93%、69.74%和79.48%。这可能说明这4种菌能产生大量植酸酶，分解了菜籽饼中的植酸。脱毒效果较差的是酵母菌和嗜酸乳杆菌，降解率分别为26.75%和11.56%。
　　2.2 单菌固体发酵菜籽饼对纤维素降解率的影响
　　在250 mL的三角瓶中装入45 g菜籽饼发酵培养基，调节含水量为50%，pH为7.0， 37 ℃下静置培养6 d，每隔1 d摇动1次，50 ℃下烘干，测定纤维素含量，并计算其降解率，结果图2所示。
　　由图2可知，通过不同的微生物发酵后，其纤维素含量均有所降低。微生物在发酵的过程中产生了纤维素酶，纤维素酶分解了纤维素，将纤维素转化为还原性糖可溶性物质，从而降低了其含量。其中，枯草芽孢杆菌对纤维素的降解率最高（30.75%），去除抗营养因子的效果最为明显。这可能是因为在发酵过程中微生物产生纤维素酶分解了纤维素。纳豆杆菌、凝结杆菌和侧胞杆菌的降解率分别为23.15%、15.32%和15.32%。乳酸菌、酵母菌对纤维素的降解率较低（7.66%）。
　　2.3 单菌固体发酵菜籽饼对单宁降解率的影响
　　2.3.1 单宁标准曲线的绘制。分别测得不同单宁浓度下的吸光度，以试剂空白为对照，以容量瓶中单宁的浓度（μg/mL）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，如图3所示。
　　2.3.2 单菌发酵对单宁降解率的影响。
　　在250 mL的三角瓶中装入45 g菜籽饼发酵培养基，调节含水量为50%，pH为7.0，37 ℃下静置培养6 d，每隔1 d摇动1次，50 ℃下烘干，测定单宁含量，并计算其降解率，结果如图4所示。
　　由图4可知，通过微生物发酵后，各自菜籽饼中单宁的含量稍有降低，说明微生物在发酵的过程中产生的单宁酶降解了一部分单宁。其中枯草芽孢杆菌对单宁的降解率最高（10.62%），对菜籽饼的脱毒有一定的效果。侧胞杆菌、纳豆杆菌、凝结杆菌对单宁的降解率分别为7.77%、5.44%和3.89%。酵母菌、乳杆菌对单宁的降解率最低分别为2.85%和1.55%，说明乳杆菌几乎不降解单宁。
　　2.4 复合微生物发酵条件研究
　　2.4.1 发酵时间的确定。将发酵培养基置于37 ℃、180 r/min恒温振荡培养。从发酵第2天开始取样，以后每隔1 d取样1次，直至第6天终止培养，在50 ℃下烘干粉碎，测定其抗营养因子的含量，并计算各抗营养因子（单宁、植酸、纤维素）的降解率。由图5可知，发酵时间达到4 d时，植酸的降解率达到最高，发酵天数为5 d时单宁、纤维素的降解率达到最高。发酵时间为6、7 d时，各抗因子的降解率基本保持不变。因此，发酵5 d是去除抗营养因子的最佳条件。 　　2.4.2 发酵温度的确定。
　　设计发酵温度为25、30、35、40 ℃，在不同的温度下发酵5 d，将采集样品在50 ℃下烘干粉碎，测定其抗营养因子的含量，并计算各抗营养因子（单宁、植酸、纤维素）的降解率。
　　由图6可知，当发酵温度为25 ℃时，抗营养因子的降解率很低，说明温度低不适合微生物的生长或影响酶的活性。当发酵温度为30～35 ℃时，各抗营养因子的降解率达到最高。当发酵温度为40 ℃时，各抗营养因子的降解率有所降低，温度高对微生物的生长、酶的活性都有影响。因此，发酵温度为35 ℃是去除抗营养因子的最佳条件。
　　2.4.3 接种量的确定。发酵的接种量设置为2%、4%、6%、8%和10%，复合菌组比例为1∶1∶1∶1，35 ℃下发酵5 d，发酵后采样在50 ℃下烘干粉碎，测定其抗营养因子的含量，并计算各抗营养因子（单宁、植酸、纤维素）的降解率。由图7可知，当接种量为2%时，各抗营养因子的降解率几乎为零，说明接种量太少时微生物的数量也少。当接种量为6%时，各因子的降解率达到最高。当接种量分别为8%和10%时，各因子的降解率有所降低，说明接种量大，微生物数量多，供微生物生长、活动的营养物质不够，导致微生物死亡。因此，发酵接种量为6%是去除抗营养因子的最佳条件。
　　2.4.4 发酵pH的确定。发酵的pH设置为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，接种量为6%，复合菌组内比例为1∶1∶1∶1，在35 ℃下发酵5 d，发酵后采样在50 ℃下烘干粉碎，测定其抗营养因子的含量，并计算单宁、植酸、纤维素的降解率。
　　由图8可知，当pH为5.5时，各抗营养因子的降解率很
　　低，说明偏酸性不适合微生物的生长，降低了各种酶的活性。
　　当pH为6.5时，降解率达到最高。当pH在7.0以上时，各因子的降解率逐渐降低。这说明碱性环境不适合微生物的生长与活动。因此，发酵的pH为6.5是去除抗营养因子的最佳条件。
　　3 结论
　　该研究对复合微生物固态发酵菜籽饼粕对抗营养因子的去除条件进行研究。从实验室提供的6种菌（酵母菌 、嗜酸乳杆菌 、枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧胞芽孢杆菌）中筛选出对抗营养因子（单宁、植酸、纤维素）降解率较高的4种优良菌株（枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧胞芽孢杆菌），用4种优良菌株复合微生物来发酵菜籽饼粕。研究去除抗营养因子的4个条件因素（发酵时间、发酵温度、发酵接种量、发酵pH）。确定其他变量，设计单一变量，筛选出每个变量的最优条件。该试验结果表明，最佳发酵条件为发酵时间为5 d，发酵温度为35 ℃，接种量为6%，发酵pH为6.5。
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