凤凰单枞茶不同香型的分类研究

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　　摘要 [目的]建立一种简单实用的凤凰单枞茶香型分类方法。[方法]应用高效液相色谱方法研究香型不同的凤凰单枞茶的指纹图谱，采用相似度分析软件进行分析比较，获得21个识别用共有特征峰;根据相对峰面积，采用判别分析法进行分类研究，初步建立凤凰单枞茶8种香型鉴定方法。[结果]能够将参与试验的52个样品按照8个香型明显分类，正确分类率为100%。其中鸭屎香和杏仁香区分明显，证明可将鸭屎香独立于杏仁香，单独归为一个香型。[结论]该研究验证了基于化学指纹图谱的凤凰单枞茶以不同香型分级判别研究是可行的。
　　关键词 凤凰单枞茶;香型;高效液相色谱;色谱指纹图谱;判别分析法
　　中图分类号 TS272  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2020）05-0193-04
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.05.055
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Abstract [Objective]A simple and practical method was established to classify Fenghuang Dancong Tea with different aromatics.[Method]The chromatographic fingerprint of Fenghuang Dancong Oolong Tea was studied by high performance liquid chromatography（HPLC）.The similarity analysis software was used to analyze and compare the fingerprints.The precision and repeatability of the method were good.Twentyone common characteristic peaks for identification were obtained. According to the relative peak area， the method of discrimination analysis was used to classify Fenghuang Dancong Tea by different aromatics， and an elevation identification method for Fenghuang Dancong Tea was preliminarily established.[Result]The results showed that fiftytwo samples were classified according to eight fragrance types， and the correct classification rate was 100%.The distinction between Yashixiang and Xingrenxiang was obvious， so the Yashixiang could be clsassified as a single aroma pattern.[Conclusion]This study verified that the Fenghuang Dancong Tea based on chemical fingerprints was practicable for differentiating the classification of different aroma types.
　　Key words Fenghuang Dancong tea;Aromatics;High performance liquid chromatography;Chromatographic fingerprint;Method of discrimination analysis
　　凤凰单枞茶是与武夷岩茶、安溪观音齐名的乌龙茶三大品系，具有特定的栽培技术和采集加工方法，已经获得了国家地理标志产品保护以及注册了国家地理标志商标，保护范围为潮州市所辖41个镇中的30个，该山区海拔为300～1 500 m，茶的立地条件以及品种有很大差异，导致茶的品质、香型多种多样。凤凰单枞茶是从凤凰水仙品种中选育出来的优异单株及其培育出来的品种、品系和株系，并采用独特的加工工艺制作而成的具有类似多种天然花香和特殊韵味品质的乌龙茶[1]。由于长期的小户分散种植，品种命名依据不统一，使得新同名异物、同物异名，品种（系）的香型难以断定，所以凤凰单枞茶的香型分类与鉴定一直受到關注。传统的以感官审评为主的香型鉴定存在一定的主观性，缺乏客观的科学依据，分类结果时有争议。香气质量是茶叶的核心竞争力之一，香气品质是影响凤凰单枞茶风味和价格的重要因素。因此亟需一种客观、科学、有效的分类鉴定方法[2]。
　　现有的对于凤凰单枞茶香型研究主要集中于：①研究挥发性物质，了解茶的呈香原理，指导茶树育种，选育培养优质的品种[3];②通过茶鲜叶所含的芳香物质成分及其在加工过程中的变化分析，对茶叶芳香物质的形成机理进行研究，改进加工方法[4];③为了通过配茶，提高低山茶、田地茶品质而进行的香型研究[5]。当茶叶流转到市场时，消费者、市场监管部门所面对的是已经加工好了的成茶，特别是茶叶国际贸易中涉及到进口商、出口商、海关以及第三方检测机构的品质验证，需要一种简单的凤凰单枞茶的香型分类方法[6]。
　　茶叶指纹图谱是指特定品种或特定产地的茶叶经处理后，采用适当分析手段，得到能表征其特征的色谱图以及数据库。如欧阳石光[7]利用 GC/GC-MS技术分析茶样香气，构建了婺源绿茶和武夷岩茶的香气指纹图谱。但是茶叶香气是挥发性或半挥发性成分，相对含量少，成分复杂，稳定性差，提取过程中易受外界条件影响发生氧化、缩合、聚合、基团转移等复杂的化学反应[8]。 　　该研究尝试直接对茶叶提取物进行高效液相分析，避开不稳定的挥发性香气成分，关注能够稳定提取的香气化学成分的整体性和模糊性，将试验分析与化学计量法两者结合分析，建立一种基于高效液相指纹图谱和判别分析法的凤凰单枞茶不同香型的鉴定方法。
　　1 材料与方法
　　1.1 仪器与设备
　　选用Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国）：DAD检测器，四元梯度泵;Millipore Advantage A10超纯水系统（美国）;梅特勒-托利多AL204-IC电子分析天平（瑞士）;CBL photoelectron TECHNOLOGY Model C9860A型超声波清洗器。
　　1.2 试剂
　　液相用乙腈、甲酸为色谱纯;液相用水为超纯水;其余试剂均为分析纯。
　　没食子酸（GA）的标准品（Dr.E）、表没食子酸儿茶素（EGC）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）的标准品（Chromadex）、儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、儿茶素没食子酸酯（CG）的标准品，北京北纳创联生物技术研究院。
　　1.3 试验材料
　　该试验材料根据《凤凰单从（枞）茶地理标志产品保护管理办法》规定的凤凰单枞茶产地范围，向当地茶农直接购买的已知香型的凤凰单枞茶样品52个，属于8种香型，分别是黄枝香4个、桂花香4个、玉兰香3个、芝兰香8个、蜜兰香9个、杏仁香5个、鸭屎香14个、姜花香5个。
　　1.4 供试品的制备
　　称取3.00 g（粉碎）干茶样，用50%乙醇在室温下浸提15 min，过滤并洗涤滤渣3次，合并滤液，冷却后定容100 mL;0.22 μm滤膜过滤后备用。
　　1.5 色谱条件
　　色谱柱：Phenomenex Synergi MAX-RP C12 80A（250 mm×4.6 mm，4 μm）;柱温30 ℃;流动相：A相为1%甲酸，B相为乙腈，B相梯度从10%到30%;流速：1 mL/min;检测时长60 min;检测波长280 nm[9]。
　　1.6 样品测定
　　吸取“1.4”所得供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行高效液相色谱检测，进样量为20 μL。按照“1.5”色谱条件分析测定，采集60 min色谱数据。
　　1.7 数据分析软件
　　用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012.130723版本）评价色谱指纹图谱相似度;使用SPSS 20.0进行数据统计分析。
　　2 结果与分析
　　2.1 色谱指纹图谱的建立
　　对上述52个已知香型的凤凰单枞的样品均进行高效液相色谱检测，在获取了每个样品的高效液相色谱图后，使用的色谱指纹图谱相似度评价软件再获取每类的凤凰单枞茶的指纹图谱的共有特征峰。
　　分别将属于不同香型的茶样品的高效液相色谱图导入色谱指纹图谱相似度评价软件中进行指纹图谱相似度分析，每类茶相似度大于0.9，生成对照图谱，使用数据匹配功能可以获得每种香型所有测试样品的共有峰;将8种不同香型的凤凰单枞茶的对照图谱使用相似度分析软件进行相似度分析，相似度大于0.9，通过匹配数据功能，获得8种不同香型凤凰单枞茶指纹图谱所具有的共有峰;确定共有特征峰的数量及与共有特征峰对应的保留时间。
　　2.2 数据标准化
　　数据标准化的目的是避免了保留时间数据漂移和色谱检测仪器造成的峰面积不一致问题，以便于使用多元分析法进行分类。样品指纹图谱进行标准化处理，首先需要确定基峰，其次样品指纹图谱中共有特征峰的保留时间和峰面积与基峰的保留时间和峰面积的比值为相对保留时间和相对峰面积。
　　2.2.1 确定基峰及指纹图谱中相同色谱峰的认定范围。
　　分析该研究收集的所有茶叶的高效液相色谱图发现，在保留时间为（17.20±0.25）min内峰面积最大峰是整个指纹图谱中峰面积最大或者次大峰;经标准品检测，该峰为表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG的色谱峰。选择该峰为基峰，进行保留时间和峰面积的标准化。同样的仪器和色谱条件下，不同次的检测，其相对保留时间的相对标准偏差小于2%。因此该研究设定对于不同茶样品指纹图谱中是否含有相同的峰的标准方法是：保留时间为（17.20±0.25）min内峰面积最大峰，即表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG的色谱峰，以该峰为基峰，计算相对保留时间，设定相对保留时间的相对标准偏差范围为2%，处于该设定范围，认为不同凤凰单枞茶样品的指纹图谱与此峰的相对保留时间一致的，是相同的色谱峰。避免了保留时间数据漂移和色谱检测仪器造成的峰不一致问题，提高鉴定模型的准确性和实用性。
　　2.2.2 保留时间和峰面积的标准化。
　　将每类样品指纹图谱中共有特征峰的保留時间和峰面积进行标准化处理。
　　分别计算每种凤凰单枞茶的指纹图谱中的共有特征峰保留时间与基峰保留时间的比值，作为相对保留时间;分别计算每个凤凰单枞茶的指纹图谱中的共有特征峰峰面积与基峰峰面积的比值，作为相对峰面积。
　　2.3 筛选识别用共有特征峰
　　从“2.1”中获得的共有峰中，筛选共有特征峰，作为识别用共有特征峰。
　　共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积作为筛选参数，相对保留时间一致的且稳定出现的峰作为凤凰单枞茶不同香型识别用共有特征峰。
　　筛选步骤：①相对峰面积排序，去除与最大峰面积比小于0.01%的共有峰。
　　②相对保留时间。根据每类凤凰单枞茶的共有特征峰的相对保留时间一一进行匹配，设定相对保留时间的相对标准偏差范围为2%，各类凤凰单枞茶的共有特征峰的相对保留时间，处于该设定范围，认为每类凤凰单枞茶指纹图谱与此峰的相对保留时间一致的，保留该峰，否则弃去。共获得21个用于凤凰单枞茶不同香型的共有特征峰（占总峰面积的 90%以上）;将此21个峰对应的相对保留时间进行集中排序，以识别用共有特征峰作为列，每个样品作为行，所述相对峰面积填入相应的单元格。不同香型的凤凰单枞茶的共有特征峰的相对保留时间如表1所示。 　　2.4 判别分析
　　上述数据集中包含8组52条单茶叶样品数据，用变量T作为样品标识。每条样品数据都由21个变量信息（记为x1，x2，…，x11）构成;并用分类变量P记录类别，P值为1代表黄枝香，P值为2代表桂花香，P值为3代表玉兰香，P值为4代表芝兰香，P值为5代表蜜兰香，P值为6代表杏仁香，P值为7代表鸭屎香，P值为8代表姜花香。使用SPSS 20.0软件，将典则判别分析源文件输入统计软件中进行典则判别分析，以P为分组变量，对数据集做判别分析。线性判别函数中选取了7个较大的特征值，累积方差达到100%，保留了变量的所有信息量，香型鉴定的典则判别特征值见表2。
　　 从8组不同香型的凤凰单枞茶样品散点图（图1）可以看到，在以典则判别函数1为X轴、典则判别函数2为Y轴的坐标图中，8组不同香型的凤凰单枞茶，其中第3类即凤凰单枞玉兰香样品明显聚集在坐标图的左侧中部;第5类即凤凰单枞蜜兰香明显聚集在坐标图的左侧上部;第1类即凤凰单枞黄枝香和第4类即凤凰单枞芝兰香明显聚集在坐标图的右侧下部，两者质心间有较大距离，有比较明显的界线;第7类即凤凰单枞鸭屎香、第2类即凤凰单枞桂花香、第8类即凤凰单枞姜花香、第6类即凤凰单枞杏仁香样品明显聚集在坐标图的右侧上和中部，四者质心间距离较大，第7类即凤凰单枞鸭屎香和第2类即凤凰单枞桂花香之间有比较明显的界线，第8类即凤凰单枞姜花香和第6类即凤凰单枞杏仁香之间也有比较明显的界线，但第2类即凤凰单枞桂花香和第8类即凤凰单枞姜花香各有一个样品重叠交叉，分类效果不很好。
　　 8组共52个样品分类结果显示，样本中的第1类即凤凰单枞黄枝香中有4个样品，没有误判;第2类即凤凰单枞桂花香中有4个样品，没有误判;第3类即凤凰单枞玉兰香样品有3个样品，没有误判;第4类即凤凰单枞芝兰香有8个样品，没有误判;第5类即凤凰单枞蜜兰香有9个样品，没有误判;第6类即凤凰单枞杏仁香有5个样品，没有误判;第7类即凤凰单枞鸭屎香有14个样品，没有误判;第8类即凤凰单枞姜花香有5个样品，没有误判。对已知香型的凤凰单枞茶样本总的正确分类率为100%。
　　茶叶提取物在给定试验条件下所得到的色谱指纹图谱反映了该茶叶的化学组成及其含量分布状况，尝试利用其特征峰鉴别茶叶不同香型。根据相似度软件进行相似度分析，发现同一香型的凤凰单枞茶指纹图谱的相似度大于0.9，不同香型的凤凰单枞茶的标准指纹图谱进行的相似度分析，相似度也都大于0.9，說明对于凤凰单枞茶来说，所含有的化学成分相似，化学成分的含量也大致相似，无法通过相似度软件直接区分不同香型的凤凰单枞茶。但是香型是影响凤凰单枞茶品质的非常重要的因素。通过共有峰的识别，筛选出21个判别分析用共有特征峰，采用判别分析方法建立凤凰单枞茶不同香型的鉴别模型。对不同香型的凤凰单枞茶的分析结果表明，对于笔者所研究的黄枝香、桂花香、玉兰香、芝兰香、蜜兰香、杏仁香、鸭屎香、姜花香，通过判别分析建立的鉴别模型鉴别准确率为100%。
　　3 小结与讨论
　　鸭屎香品种的凤凰单枞茶香型一般认为属于杏仁香，该研究通过高效液相指纹图谱结合模式识别技术，得出的结论是鸭屎香可以和杏仁香的凤凰单枞茶进行有效区分，这与杨环等[10]的研究结论是一致的。验证了基于化学指纹图谱的凤凰单枞茶以不同香型分级判别研究是可行的。
　　该研究利用指纹图谱技术和化学计量法软件对不同香型凤凰单枞的茶叶进行研究，获得21个判别用共有特征峰，进行判别分析，判别结果鉴别准确率为100%，一定程度上反映了该鉴别方法的应用前景，以改变人工感官评审的方法，使茶叶审评客观化、科学化和标准化。该研究虽然只针对凤凰单枞茶进行不同香型的分类与鉴定，但仍然可以作为凤凰单枞茶其他品质识别研究的参考。
　　对凤凰单枞茶品质特点的分析应从多方面入手，综合从感观审评、生化成分以及分子水平上来分析各单枞茶的差异，才能比较全面地分析各单枞的品质差异，为其生产加工提供理论指导[10]。但是对于茶叶贸易各方的品质控制而言，简单经济的鉴定方法更有实用价值。该研究的特点是仅从高效液相色谱指纹图谱方面对凤凰单枞代表样茶进行了香型的比较分析，避免了香型化学成分的提取和分析需要的复杂过程，分类效果良好。
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