种子处理对PEG-6000模拟渗透胁迫下棉花发芽的影响

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　　摘要：为探讨干旱胁迫下不同处理剂对包衣棉花种子萌发的影响，以不同药种比例二次拌种处理，用质量浓度10、20 g/L的PEG-6000溶液模拟土壤干旱进行发芽试验。对干旱胁迫下种子萌发期的相对发芽率、相对幼芽含水率、相对发芽指数、相对活力指数、萌发抗旱指数、相对平均发芽速率等指标进行测定，应用多元统计分析方法进行抗旱性综合评价，以确定不同处理剂的作用效果以及棉花萌芽期简单易用的抗旱鉴定指标。结果表明：（1）随着PEG-6000质量浓度的升高，各处理的发芽指数相对值、活力指数相对值、萌发抗旱指数相对值和综合抗旱评价值（D值）总体上呈下降态势。（2）处理剂Ⅰ提高种子萌发抗旱性的作用效果明显优于处理剂Ⅱ。（3）与抗旱综合评价相关的相对发芽指数、相对幼芽含水率、相对鲜质量和相对平均发芽率4个指标可有效鉴定不同处理的种子萌发抗旱性。
　　关键词：棉花;PEG胁迫;萌发期;抗旱性
　　中图分类号： S562.01;Q945.78
　　文献标志码： A
　　文章编号：1002-1302（2020）02-0091-06
　　收稿日期：2019-01-26
　　作者简介：张卫杰（1990—），男，河南周口人，硕士，研究方向为重金属迁移与转化。E-mail：1317282732@qq.com。
　　通信作者：乔传令，博士，研究员，主要从事环境生物学研究。E-mail：qiaocl@ioz.ac.cn。
　　水资源短缺是目前公认的全球性环境焦点问题之一，中国干旱及半干旱地区面积占全国总耕地面积的48%，干旱胁迫对农作物造成的损失在所有非生物胁迫中占首位[1-2]，已经成为限制农业发展的重要障碍。棉花作为我国重要的经济作物多分布于盐碱干旱地区，而且其生长的主要季节为高温干旱的夏季，水分匮缺成为棉花播种期或其他关键生育期生长发育的限制性因素[3]。随着生物技术的飞速发展，提高农作物的抗旱性已经成为农业研究领域的热点之一。γ-聚谷氨酸（γ-PGA）是由微生物发酵产生的一种γ-谷氨酸链状高聚物，它富含侧链羧基，具有无毒、无害、无残留等特性，還具有高吸水保水性，在农业上常用作保水剂和种子包衣剂[4-6]。用电子束轰击γ-PGA制成的树脂对种子进行包埋后，种子能够在沙漠和缺水地区顺利发芽[7]。施用γ-PGA水浸液或直接拌种，可提高小麦出苗率[8]。在用聚乙二醇（PEG-6000）模拟干旱胁迫下，使用外源γ-PGA后，可提高小麦和黑麦草的发芽率[8-9]，增强水稻幼苗的耐旱性[10]。迄今为止，γ-PGA用于抗干旱的研究大多集中于小麦、水稻、玉米等作物，在棉花上的相关研究较为滞后。本研究将γ-PGA与其他成分复配后配合种衣剂处理棉花种子，并利用高分子渗透剂PEG-6000模拟干旱胁迫，通过分析不同处理棉花种子的发芽特性，对与种子萌发期抗旱性相关的多个指标进行系统分析与鉴选，初步建立抗旱性评价指标体系，并对不同处理的种子进行萌发抗旱性综合评价，为种子处理技术在干旱条件下的棉花生产提供科学依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 供试材料
　　供试品种为中棉所42（已用20%拌种灵·福美双·锌包衣），由中国农业科学院棉花研究所选育，种子处理剂Ⅰ、Ⅱ由河南奈安生物科技股份有限公司/农药副作用及药害防控技术河南省工程实验室自主研发。处理剂Ⅰ主要有效成分：γ-聚谷氨酸、水溶性腐殖酸和无机盐;处理剂Ⅱ主要有效成分：γ- 聚谷氨酸、生化黄腐酸和聚阴离子纤维素。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 种子处理 选取颗粒饱满大小一致的棉花种子置于40 ℃恒温箱中干燥24 h，分别用处理剂样品处理后自然晾干，拌种比为1 ∶50、1 ∶75和 1 ∶100。然后置于质量浓度为0、10、20 g/L（对应的渗透势分别为0、-0.15、-0.46 MPa）的PEG-6000溶液中于25 ℃培养箱中光暗交替恒温培养 12 d，每24 h补充1次水分使渗透势维持不变，以芽长超过0.5 cm且无腐烂变质的种子为正常发芽，每天开始统计发芽数和芽长。共设置15个处理（表1），每个处理设2个培养皿，每皿100粒，重复2次。培养皿（直径 9 cm）和滤纸事先121 ℃高温灭菌消毒 30 min，每个培养皿垫2层风干的滤纸。
　　1.2.2 测定指标及方法 种子开始培养后每天观察并记录种子发芽情况;培养至第8天调查种子发芽情况（发芽数、鲜质量、干质量），计算发芽率、发芽指数、幼芽含水率、活力指数、种子萌发抗旱指数、干物质胁迫指数等指标。
　　式中：Gt表示在第t天的发芽数;Dt表示与Gt相对应种子出芽经历时间;S表示规定时间（7 d）内单株幼苗的生物量（干质量）。
　　幼芽含水率=1-幼芽干质量/幼芽鲜质量;种子萌发抗旱指数=水分胁迫下种子萌发指数（PIS）/对照种子萌发指数（PIC），其中PI=1.00nd2+0.75nd4+0.5nd6+0.25nd8（nd2、nd4、nd6、nd8分别是2、4、6、8 d的种子萌发率）[12];干物质胁迫指数=干旱下幼苗干质量/对照幼苗干质量[13]。
　　1.2.3 数据统计与分析 数据整理与分析采用Excel 2007软件。参照周广生等的方法[14-15]将各指标的原始数据转化为相对值，运用SPSS 18.0软件对各指标的相对值进行主成分分析，并利用隶属函数值对不同处理的棉花种子萌芽期的耐渗透胁迫进行综合评价。运用的主要公式如下：
　　2 结果与分析
　　2.1 测定指标相对值的分析
　　由表2可见，在PEG-6000模拟渗透胁迫下，各处理的指标与正常对照相比（相对值）均受到了不同程度的影响，不同处理经模拟渗透胁迫后其发芽率、发芽指数、活力指数、萌发指数基本上均有所下降（相对值<1），而鲜质量和幼芽含水率大部分都有所上升（相对值>1）。PEG-6000浓度为 20 g/L 的各处理的发芽指数相对值、活力指数相对值和萌发抗旱指数相对值均小于PEG-6000浓度为10 g/L的各处理，但不同处理各单项指标的变化幅度不尽相同，各有差异。各指标的相对值在一些文献中又叫做抗胁迫系数或抗旱系数[16-18]，仅指示该指标下的耐冷性强弱。由于各处理的抗旱性和各指标所提供的信息均有较大差异，如仅根据单一指标的测定值得出结论难免有一定的片面性，所以需要将这些指标综合起来进行抗旱性评价。 　　2.2 萌发期抗旱指标的主成分分析
　　Bouslama等提出，根据种子在高渗溶液或在不同渗透势土壤中的发芽率和发芽势来评价萌发期抗旱性，并提出用种子萌发抗旱指数来反映种子在高渗溶液中的发芽势和发芽率，在一定程度上能间接反映作物萌发期的抗旱性[19]。本试验将种子萌发抗旱指数作为代表各处理抗旱性强弱的指标与测定的各项指标进行相关性分析（表3），并将表2提供的数据作为主成分分析的原数据矩阵，利用软件进一步分析得到各项指标的相关系数矩阵，根据相关系数矩阵，得出各综合指标的特征值，筛选特征值>1的主成分并计算得到各指标的主成分特征向量（表4）。
　　表3相关性分析显示：发芽率、发芽指数和活力指数与种子萌发抗旱指数的相关系数明显高于其他指标，相关极显著（P<0.01），即以上3个指标在一定程度上与各处理棉花种子萌发的抗旱性密切相关，这与表4中主成分CI-1传递的信息一致。由表4可知第一、第二和第三主成分的贡献率分别是57.364%、18.905%和13.643%，三者累计贡献率达89.912%，代表了所测指标的绝大部分信息，其他主成分可忽略不计。从特征向量上各个独立指标在综合指标中的贡献率来看，第一主成分（CI-1）中种子萌发抗旱指数、发芽指数、活力指数、发芽率所占的比重较大，说明这些指标可以较好地反映种子萌发的抗旱性;第二主成分（CI-2）中鲜质量、干物质胁迫指数、幼芽含水率所占的比重较大;第三主成分（CI-3）中幼芽含水率、干物质胁迫系数和鲜质量所占比重较大，说明这些指标与种子萌发的抗旱性也存在一定关系。
　　2.3 抗旱性综合评价
　　在各主成分的特征向量（表4）及各指标的相对值（表2）基础上，可分别求出每个处理的3个综合指标值（表5）。在干旱胁迫下，同一综合指标数值越大，说明该处理在这一综合指标上的抗旱性越强，反之越差。但各处理的抗旱性由这3个综合指标值所共同决定，单独用任何一个综合指标都无法准确评价出不同处理种子萌发的抗旱性。因此在综合指标基础上结合权重利用隶属函数计算各处理综合抗旱能力的大小（D值）更具科学性，结果见表5。
　　从表5中不同处理的D值和排序对比发现：相同排序位次下，所有Ⅰ类D值>Ⅱ类D值，说明模拟渗透胁迫压力越大（PEG-6000处理质量浓度越高），对棉花种子萌发的影响越大，抗旱能力越弱;而抗旱剂处理后在轻度模拟渗透胁迫下（PEG-6000处理质量浓度为10 g/L）棉花包衣种子萌芽期的抗旱性（D值）基本上要优于高浓度模拟渗透胁迫（PEG-6000处理质量浓度为20 g/L）的抗旱性。事实上，处理1是Ⅰ类的对照，处理2是Ⅱ类的对照，在Ⅰ类中超过处理1排序位次的是处理5（第1位）、处理3（第2位）和处理13（第3位），在Ⅱ类中超过处理2排序位次的是处理4（第1位）、处理6（第2位）和处理14（第3位）。在表1中处理3至处理6均采用处理剂Ⅰ，拌种比1 ∶50～1 ∶75，处理13、处理14采用处理剂Ⅱ，拌种比1 ∶100，处理剂Ⅱ的各处理排序位次均在处理剂Ⅰ之下，说明使用处理剂Ⅰ提高种子萌发抗旱性的作用效果明显优于处理剂Ⅱ，其最佳拌种比为1 ∶50和1 ∶75。处理13、处理14的排序在Ⅰ类和Ⅱ类的对照之上，说明处理剂Ⅱ使用拌种比 1 ∶100 也具有提高种子萌发抗旱性的效果。
　　2.4 回归分析
　　从上述分析结果（表4）可以看出，不同指标对棉花抗旱性贡献大小不同。进一步以抗旱性综合评价值（D值）作因变量，各单项指标相对值作自变量，通过逐步回归分析建立多元线性逐步回归方程，并获取对抗旱性评价最重要的指标。回归方程见表6，回归模型经回归系数测验和决定系数验证，都达到极显著水平，而且回归方程（4）的相关系数达0.998，高于回归方程（5）的相关系数（0.845），说明前者的拟合度更好，模型更准确，而且说明该模型涉及的指标（发芽指数、幼芽含水率、相对鲜质量和平均发芽速率）是种子萌发抗旱性的关键指标，可有效鉴定棉花种子萌发的抗旱性。在模拟渗透胁迫下，这些指标与萌发抗旱性存在线性关系，而回归方程（6）表明直接决定萌发抗旱指数的仅有发芽指数和发芽率这2个指标，而且方程（5）的相关系数小于方程（4），因此用萌发抗旱指数直接衡量萌发抗旱性存在偏差。
　　3 结论与讨论
　　作物在生长发育过程中对缺水最敏感，水分欠缺会使生长减缓或停止。因此在干旱条件下作物生长状况的差异可用来评定不同处理抗旱性的差异，而形态指标具有简单易测的优点，反映了作物在遭受干旱胁迫后植株的整体表现，在鉴定中经常采用，成为简便有效的抗旱性鉴定方法[17]。
　　一般采用种子萌发试验，即用不同质量浓度的PEG-6000或甘露醇对种子发芽进行渗透胁迫处理，可以揭示作物在萌发期的抗旱能力[20-21]。种子在高渗溶液或在不同渗透势的土壤中萌发，可根据其发芽势和发芽率来评价抗旱性[19]。一般在渗透胁迫条件下发芽率降低，胚根与胚芽的生长受到不同程度的抑制，使贮藏物质转运效率降低。其中发芽率和胚根干质量与萌发抗旱指数呈极显著正相关[22]。作物干旱一段时间后测定幼苗的株高、含水率和干质量，并与对照比较（株高胁迫指数、相对含水率和干物质胁迫指数），由此鉴定相关的抗旱性，该方法简单有效，已在大豆、棉花、小麦等作物上得到应用[17]。本研究通过主成分分析和多元回归分析显示发芽率、萌发抗旱指数、发芽指数和含水率等指标能够明确地反映萌发抗旱性，与前人的研究结果基本一致。
　　在主成分分析（表4）中种子萌发抗旱指数、发芽指数、活力指数、发芽率可以较好地反映种子萌发的抗旱性，而在回归分析（表6）中发芽指数、鲜质量、幼芽含水率、平均发芽速率直接影响各处理种子萌发的综合抗旱性，各指标与后者的关系呈线性。说明萌发抗旱指数和活力指数并不是直接影响种子萌发抗旱性，与后者的关系呈非线性。发芽指数几乎直接决定萌发抗旱指数[表6方程（6）]，两者的相关系数r高达0.975（表3、表6），两者仅反映干旱时的发芽率和发芽势，代表的是种子发芽力[11]。而直接决定各处理萌发抗旱性相关的指标不仅有发芽指数，还有反映种子萌发吸水能力的幼芽含水率和不属于种子发芽力范围之外的幼芽鲜质量[表6方程（4）]，因此，种子处理对模拟干旱环境下棉花发芽的作用不仅在于影响种子自身的发芽力，还影响种子萌发生长过程中对水分的吸收和自身的生长发育，所以萌发抗旱指數明确反映的是种子萌发力抗旱性，虽然在一定程度上能够间接反映种子萌发抗旱性，但若要全面体现这种抗旱性则具有片面性和局限性。 　　由于主成分分析可以把单一的关系错综复杂的指标转换成新的个数较少的且彼此独立或不相关的综合指标，比较准确地了解各性状的综合表现，因此对与萌发抗旱性相关指标的分析比较全面详细，而直线回归分析筛选相关指标则更加直接简单。本研究综合利用这2种分析方法分辨不同指标与萌发抗旱性的关系，并结合隶属函数和综合评价方法判定不同处理的种子萌发抗旱性，并以此区分不同处理剂的作用效果更加科学合理。
　　利用外源物质提高作物抗旱性的研究比较普遍，目前已报道的主要有冠菌素、茉莉酸或茉莉酸甲酯、乙烯利、赤霉素、吲哚乙酸·萘乙酸等激素及其类似物质[23-25]，黄腐酸类光谱植物生长调节剂以及聚丙烯酰胺、γ-聚谷氨酸等高分子有机保水剂[26-27，10]。茉莉酸类物质是广泛存在于植物体内的一类生长调节物质，包括茉莉酸、茉莉酸甲酯及其結构类似物冠菌素等，此类物质具有应答外界刺激，传导逆境信号及启动抗逆基因表达等生理效应，调节作物幼苗体内的激素平衡来诱导其形态的改变，增强其抗旱性[23-24]。黄腐酸能控制作物叶面气孔的开放度，减少蒸腾，增强根系发育和根系活力，促进植物的生长，从而增强植物的抗旱性及抗逆能力，提高作物产量和品质[28]。γ-PGA作为一种具有极强亲水性的高分子聚合物处理种子，在种子表面形成一层膜，能阻止水分流失，为种子发芽提供了所需要的水分，而且还可以调节植物内源激素水平及其稳态平衡，促进种子萌发和幼苗生长发育[29-30]。部分激素及其类似物如使用不当易在土壤和作物体内残留，不仅影响作物生长发育，而且引发食品安全问题[31]，因此本研究选取无毒无害、绿色环保的腐殖酸类（黄腐酸）、γ-PGA作为主要成分复配处理剂，研究发现该处理剂提高了干旱胁迫下种子的发芽率、发芽指数、活力指数和萌发抗旱指数，增强包衣棉花种子萌发时的抗旱性，具有一定的应用价值。
　　综上所述，应用不同处理剂对包衣棉花种子二次拌种后各处理种子萌发抗旱性存在差异，这与不同处理剂的有效成分不同以及拌种比例不同有关，也可能与种衣剂和处理剂之间的互作有关。在适当范围内，种子处理后的萌发抗旱性明显优于对照，但其在大田中的效果如何尚待进一步研究。
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