有机磷水解酶对甲基对硫磷的快速降解及检测

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　　摘要：甲基对硫磷是一种毒性较强的有机磷农药，常被用作菜农用作杀虫剂，有机磷水解酶可通过切断甲基对硫磷中的PO键实现对甲基对硫磷的快速、高效降解。通过对有机磷水解酶降解条件进行优化，得到有机磷水解酶最优的农药降解条件：酶浓度为1 ∶1 000、pH值为8、降解温度为37 ℃、降解时间为10 min。通过气相色谱法测得有机磷水解酶对1、5、10 μg/mL甲基对硫磷的降解率均达到98%以上，因此在生产中有机磷水解酶可作为针对甲基对硫磷的高效快速降解酶进行推广使用。
　　关键词：甲基对硫磷;有机磷水解酶;对硝基酚;快速降解;农药残留
　　中图分类号： S481+.8;X592文献标志码： A
　　文章编号：1002-1302（2020）04-0186-06
　　收稿日期：2018-12-16
　　基金项目：国家重点研发计划（编号：2016YFF0202302-03）。
　　作者简介：白俊岩（1994—），女，河北承德人，硕士研究生，研究方向为食品工程。E-mail：1129901984@qq.com。
　　通信作者：霍书英，博士，副教授，从事农药残留和生殖内分泌研究。E-mail：huoshuying@163.com。
　　我国是一个传统的农业大国，农药的使用量一直居于世界首位，每年达80万～100万t[1]。为减轻病害虫对农产品的影响，滥用农药的现象经常发生。由于农药残留检测方法受限，管理监察力度不够，高毒农药的生产以及使用情况时有发生，造成水果蔬菜等农产品质量下降，农药残留量超标，严重危害人类的健康[2]。
　　甲基对硫磷是一种毒性较强的有机磷农药，虽然已被国家禁用，但总有菜农偷偷用来作高效杀虫剂，有机磷农药的广泛使用在提高农产品质量和产出的同时也存在食品安全隐患[3]。因此，严格进行食用蔬菜有机磷农药残留的检测和控制，对于保证蔬菜品质、维护人类健康、减少土壤污染和保护环境非常重要。2011年，黄文水报道了蔬菜中甲基对硫磷农药残留的多种检测方法，包括气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用技术等在内的诸多仪器检测方法，但这些方法均存在操作步骤繁多、回收率低、对技术条件要求高、不易广泛推广应用等缺点[4]。2017年，白云鹏等报道了有机磷水解酶在一定条件下可直接通过切断甲基对硫磷中的PO 键，从而达到对甲基对硫磷的高效降解[5]。因此，本试验利用有机磷水解酶对甲基对硫磷具有高效降解特性，可将甲基对硫磷分解产生等摩尔的黄色对硝基酚，通过测定产物对硝基酚的量即可计算蔬菜中甲基对硫磷农药的残留量，从而试图建立一种利用有机磷水解酶快速检测水果、蔬菜中甲基对硫磷残留量的简单可行方法，以实现对水果、蔬菜甲基对硫磷的降解和检测控制。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与试剂
　　有机磷水解酶（organophosphorus hydrolase，简称OPH）（酶活性≥11 μmol/min·mg），购自北京森根瑞亚公司;甲基对硫磷标准品（methyl parathion，简称MEP;CAS号：298-00-0：购自天津一方恒益医药技术有限公司;磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、三氯乙酸、碳酸鈉、无水乙醇、亚硝酸钠等，均购自天津市福晨化学试剂厂;4-硝基苯酚，购自成都艾科达化学试剂有限公司;乙腈、丙酮（色谱纯）购自德国Merck公司。
　　1.2 仪器与设备
　　主要的仪器有：Bio-rad酶标仪（美国伯乐）、Cp214电子天平[奥豪斯仪器（上海）有限公司制造]、pHS-3C酸度计（上海佑科仪器仪表有限公司）、YMDCY-12S水浴氮吹仪（上海育模仪器有限公司）、HH-W600数显恒温三用水箱（金坛市朗博仪器制造有限公司）;气相色谱仪（带氮磷检测器，备有毛细管柱，美国Thermo）：TRACE GC ULTRA、RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、YDp-02型真空泵（上海育模仪器有限公司）、通风柜（北京欧世佳实验室家具有限公司）、QL-861型旋涡混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）、YDp-02型真空泵（上海育模仪器有限公司）、pHS-3DW型分析天平（上海仪电分析仪器有限公司）。
　　1.3 有机磷水解酶降解条件的优化
　　1.3.1 对硝基酚标准曲线的绘制
　　准确称取0.083 64 g 对硝基酚标准品，先用少量95%乙醇溶解，然后用水定容至100 mL，浓度为6 mmol/L。按表1分别加入不同量的对硝基酚和50 mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH值为8），由2号管取出500 μL混合液加入3号管混合，然后取出500 μL加入4号管，以此类推配成不同浓度（0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 μmol/L）的对硝基酚标准液，然后加入0.5 mL 10%三氯乙酸，再加入0.5 mL 10% Na2CO3显色，使用酶标仪在450 nm处测定吸光度，绘制对硝基酚浓度-吸光度的标准曲线，试验设3次重复。
　　1.3.2 不同浓度的有机磷水解酶对甲基对硫磷降解效果的影响
　　用pH值为8的50 mmol/L磷酸盐缓冲液配制不同浓度（1 ∶500、1 ∶1 000、1 ∶2 000、1 ∶3 000、1 ∶4 000、1 ∶5 000、1 ∶6 000、1 ∶7 000、1 ∶8 000）的有机磷水解酶，取0.325 mL甲基对硫磷和0.175 mL各个浓度的有机磷水解酶于离心管中，在温度为37 ℃条件下反应1 min，反应结束后加入0.5 mL 10%三氯乙酸进行终止，再加入0.5 mL 10% Na2CO3显色，使用酶标仪在450 nm处测定吸光度，并根据甲基对硫磷降解产物对硝基酚与甲基对硫磷浓度的线性关系，计算不同浓度的有机磷水解酶对甲基对硫磷的降解率，试验设3次重复。 　　1.3.3 不同pH值对有机磷水解酶降解效果的影响
　　分别用pH值为5、6、7、8、9、10的50 mmol/L磷酸盐缓冲液配制1 ∶1 000的有机磷水解酶，取0.325 mL 甲基对硫磷和0.175 mL各个pH值的有机磷水解酶于离心管中，在温度为37 ℃条件下反应1 min，反应结束后加入0.5 mL 10%三氯乙酸进行终止，再加入0.5 mL 10% Na2CO3显色，使用酶标仪在450 nm处测定吸光度，并根据甲基对硫磷降解产物对硝基酚与甲基对硫磷浓度的线性关系，计算不同pH值下有机磷水解酶对甲基对硫磷的降解率，试验重复3次。
　　1.3.4 不同反应温度对有机磷水解酶降解效果的影响
　　用pH值为8的50 mmol/L磷酸盐缓冲液配制1 ∶1 000的有机磷水解酶，取0.325 mL甲基对硫磷和0.175 mL有机磷水解酶于离心管中，分别在不同温度（4、27、37、47、57、67、77 ℃）下反应1 min，反应结束后加入0.5 mL 10%三氯乙酸进行终止，再加入0.5 mL 10% Na2CO3显色，使用酶标仪在450 nm 处测定吸光度，并根据甲基对硫磷降解产物对硝基酚与甲基对硫磷浓度的线性关系，计算有机磷水解酶不同反应温度对甲基对硫磷的降解率，试验设3次重复。
　　1.3.5 不同反应时间对有机磷水解酶降解效果的影响
　　用pH值为8的50 mmol/L磷酸盐缓冲液配制1 ∶1 000的有机磷水解酶，取0.325 mL甲基对硫磷和0.175 mL有机磷水解酶于离心管中，在温度37 ℃ 条件下反应不同时间（0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10 min），反应结束后加入0.5 mL 10%三氯乙酸进行终止，再加入0.5 mL 10% Na2CO3显色，使用酶标仪在450 nm处测定吸光度，并根据甲基对硫磷降解产物对硝基酚与甲基对硫磷浓度的线性关系，计算有机磷水解酶不同反应时间对甲基对硫磷的降解率，试验设3次重复。
　　1.4 有机磷水解酶对甲基对硫磷降解功效的气相色谱法测定
　　1.4.1 甲基对硫磷浓度-峰面积标准曲线的绘制
　　用100 mg/L的农药标准品分别配成2.000 00、1.000 00、0.500 00、0.250 00、0.125 00、0.062 50、0.031 25 μg/mL丙酮溶液，使用气相色谱测定峰面积，绘制浓度-峰面积的标准曲线，试验设3次重复。
　　1.4.2 有机磷水解酶对甲基对硫磷的降解反应条件
　　取10 mL 1、5、10 μg/mL有机磷农药工作液，分别加入5 mL 1 ∶500的有机磷水解酶，对照组加入等量的磷酸盐缓冲液，置于37 ℃生化培养箱中进行降解反应，反应10 min后取出迅速加入30 mL乙腈萃取降解反应后残留的农药底物，颠倒混匀，加入5 g 氯化钠，剧烈振荡1 min，4 000 r/s离心5 min，取出10 mL乙腈相，相当于样品量的1/3，移入50 mL 旋转蒸发瓶中，先用旋转蒸发器浓缩至1 mL，再用氮吹仪在室温下浓缩至近干，用丙酮定容至1 mL，供氣相色谱测定，然后计算有机磷水解酶对甲基对硫磷的降解率。
　　有机磷水解酶对有机磷农药降解效率的计算公式：
　　R=X-X0X×100%。
　　式中：R表示生物制品的降解效率;X表示反应体系中降解反应前标准农药的浓度;X0表示反应体系中降解反应结束后残留农药的浓度。
　　1.4.3 气相色谱测定条件
　　气相色谱仪型号为Thermo TRACE GC ULTRA;色谱柱为石英毛细管柱，DB-1701，30 m×0.53 mm（内径）×1.0 μm（膜厚）;载气：氮气（纯度大于99.999%）;载气流速为10 mL/min，尾吹气流速为30 mL/min;氢气流速为75 mL/min，空气流速为100 mL/min;柱温：初始温度为150 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升至270 ℃，保持15 min;进样口温度为250 ℃;检测器温度为250 ℃;进样方式：不分流进样;进样量为1 μL;开阀时间为1.5 min。
　　1.5 有机磷水解酶对叶类蔬菜中甲基对硫磷残留量的快速检测
　　1.5.1 不同浓度的甲基对硫磷与有机磷水解酶降解产物吸光值的线性关系
　　用pH值为8的50 mmol/L 磷酸盐缓冲液配制不同浓度（0.1、1.0、10.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1 000.0 μg/mL）的甲基对硫磷加入1 ∶500 的有机磷水解酶，取0.325 mL 甲基对硫磷和0.175 mL有机磷水解酶于离心管中，在温度为37 ℃ 条件下反应10 min，反应结束后加入0.5 mL 10%三氯乙酸进行终止，再加入0.5 mL 10% Na2CO3显色，使用酶标仪在450 nm处测定吸光度，绘制线性曲线图，试验设3次重复。
　　1.5.2 叶类蔬菜中甲基对硫磷残留的快速检测
　　1.5.2.1 蔬菜样品的处理
　　选取新鲜的未接触任何农药的油菜（来自河北农业大学试验基地），试验组喷洒等量1、5、10 μg/mL甲基对硫磷，静置1 h，对照组只喷洒相同量的磷酸盐缓冲液，静置1 h。采用分点取样法准确称取10 g蔬菜，剪成1 cm见方碎片，放入烧杯中，加入20 mL乙腈浸泡20 min。过滤得到提取液，然后加5 g NaCl振荡1 min，3 000 r/s 离心10 min，取出 10 mL乙腈相，移入50 mL旋转蒸发瓶中，先用旋转蒸发器浓缩至1 mL，再用氮吹仪在室温下浓缩至近干。 　　1.5.2.2 样品测定
　　向吹至近干的样品中加入0.3 mL磷酸盐缓冲液和0.2 mL浓度为1 ∶500的有机磷水解酶，37 ℃反应10 min，然后加入0.2 mL次氯酸钠和0.3 mL亚硝酸钠，室温静置10 min，3 000 r/s 离心3 min，取出0.5 mL上清液先加入0.5 mL 10%三氯乙酸终止反应，再加入0.5 mL 10% Na2CO3显色，使用酶标仪在450 nm处测定吸光度，试验设3次重复。
　　2 结果与分析
　　2.1 对硝基酚浓度-吸光度标准曲线的建立
　　由图1可知，对硝基酚标准曲线方程为y=0.002 2x-0.003，回归相关系数r2=0.999 7。说明对硝基酚浓度与吸光度呈正相关，可以通过测定吸光度计算得到对硝基酚的浓度。
　　2.2 有机磷水解酶降解条件的优化结果
　　2.2.1 不同浓度的有机磷水解酶对甲基对硫磷降解率的影响
　　由图2可知，有机磷水解酶在浓度为1 ∶500、1 ∶1 000、1 ∶2 000时，对甲基对硫磷的降解率均在96%以上，随着有机磷水解酶浓度的降低，对甲基对硫磷的降解率也在下降。综合考虑，选择有机磷水解酶浓度为1 ∶1 000进行后续试验。
　　2.2.2 不同pH值对有机磷水解酶对甲基对硫磷的降解率的影响
　　由图3可知，随着pH值的升高，有机磷水解酶对甲基对硫磷的降解率不断升高，当pH值为8时有机磷水解酶对甲基对硫磷的降解率达到最高，为95.55%，随着pH值的继续上升，有机磷水解酶对甲基对硫磷的降解率逐渐下降。所以，选择pH值为8进行后续试验。
　　2.2.3 不同反应温度对有机磷水解酶对甲基对硫磷的降解率的影响
　　由图4可知，随着温度的升高，有机磷水解酶对甲基对硫磷的降解率不断升高，当温度达到47 ℃时，有机磷水解酶对甲基对硫磷的降解率达到最高，为94.51%。综合考虑，选择降解温度为37 ℃进行后续试验。
　　2.2.4 不同反应时间对有机磷水解酶对甲基对硫磷的降解率的影响
　　由图5可知，反应时间为0.5，1、1.5、2、3、4、6、8、10 min，有机磷水解酶降解率均维持在89%以上。综合考虑，选择降解时间为10 min 进行后续试验。
　　2.3 有机磷水解酶降解功效的气相色谱测定结果
　　由图6可知，出峰时间为10.35 min;由图7可知，甲基对硫磷浓度与峰面积呈线性关系，r2=0.998 1。由表2可知，有机磷水解酶（1 ∶1 000）對1、5、10 μg/mL的甲基对硫磷的降解率均达到98%以上，农药回收率均在93%～105%之间。
　　2.4 有机磷水解酶对叶类蔬菜甲基对硫磷残留的快速检测
　　2.4.1 不同浓度甲基对硫磷与有机磷水解酶降解产物对硝基酚吸光度的线性关系
　　由图8可知，有机磷水解酶对不同浓度甲基对硫磷进行降解，在1～1 000 μg/mL浓度范围内降解产物对硝基酚450 nm 下的吸光度与甲基对硫磷浓度呈线性关系，回归相关系数r2=0.999 1。因此，可利用有机磷水解酶对甲基对硫磷高效快速降解的特点，通过检测降解产物对硝基酚的含量即可计算出反应物甲基对硫磷的量。
　　2.4.2 有机磷水解酶对叶类蔬菜农药残留的检测结果
　　由表3可知，无农药油菜喷洒不同浓度甲基对硫磷后，按“1.5.2.1”节抽提农药，利用有机磷水解酶对其进行降解，根据试验测得的D450 nm计算出油菜中农药残留量分别为0.133、2.133、6.133 μg/g。此方法操作简便，高效快速，便于掌握，更有利于推广使用。
　　3 结果与讨论
　　通过对有机磷水解酶降解条件进行优化，得出有机磷水解酶最优的农药降解条件：酶浓度为1 ∶1 000、pH值为8、降解温度为37 ℃、降解时间为10 min。通过气相色谱法测得有机磷水解酶对1、5、10 μg/mL甲基对硫磷的降解率均达到98%以上，因此在生产中有机磷水解酶可作为针对甲基对硫磷的高效快速降解酶进行推广使用。另外，利用有机磷水解酶对甲基对硫磷具有高效降解特性，建立了一种简便快速检测水果、蔬菜中甲基对硫磷残留量的新方法。
　　首先建立甲基对硫磷不同浓度和有机磷水解酶降解产物对硝基酚吸光值的标准曲线，并参照国家标准[6]中叶类蔬菜农药残留量的测定方法中农药的抽提方法并加以改进，建立了相对稳定的有机磷水解酶反应体系和残留农药的抽提方法，并进行了多次重复，结果稳定。此方法操作简便，高效快速，便于掌握，检测成本低，因此更有利于在生产中推广使用，这种快速检测法的建立，可在监督环节发挥重要作用，有利于及时发现问题、采取措施[7]。
　　蔬菜是人们餐桌上必不可少的食物，但农药残留超标问题已引起社会各界的广泛关注，利用有机磷水解酶对甲基对硫磷的高效快速降解的特点，通过喷洒有机磷水解酶解决甲基对硫磷类农药的残留问题，并通过快速检测水果、蔬菜中甲基对硫磷的残留量，控制高残留农药蔬菜水果流入市场，降低农药中毒发生率，保障消费者的安全[8]。
　　随着人们对水果、蔬菜中农药残留及食品安全性问题的关注，及各种技术纵向的发展与横向的联用，农药残留快速检测技术的研究也将不断深入发展[9]，在提出的高效快速检测方法的基础上还可以利用有机磷水解酶进一步研制更便捷的农药残留检测产品，比如农药测定试剂盒[10]、检测试纸[11]或便携式分光光度计检测枪等，这些产品若研制成功将实现随时随地对水果蔬菜进行农药残留检测，确保水果蔬菜的安全性，为人类健康保驾护航。
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