节旋藻对Pb2+生理响应及吸附效应研究

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　　摘要 通过测定不同Pb2+浓度下节旋藻的生理响应，探讨Pb2+对节旋藻生理特性的影响及节旋藻对重金属Pb2+的吸附效应。结果表明，Pb2+对节旋藻形态与生理特性具有显著影响;当水环境中Pb2+浓度为50 mg/L时，对节旋藻的生长具有明显的抑制作用，此时藻体内的藻胆蛋白、叶绿素a和类胡萝卜素含量都出现最低值，并且藻蓝蛋白对Pb2+浓度变化的生理反应比别藻蓝蛋白更为敏感。节旋藻对Pb2+的吸附量大致与Pb2+浓度呈正相关，但在40～50 mg/L时吸附量急剧增加;吸附率大致与Pb2+浓度呈负相关，但在40 mg/L时吸附率急剧增加。可见，节旋藻作为处理废水中重金属Pb2+的生物吸附剂时，其吸附效应与节旋藻的生理状态及Pb2+浓度有很大关系，对节旋藻吸附重金属Pb2+的初步研究为节旋藻作为生物吸附剂的广泛应用提供理论基础。
　　关键词 节旋藻;Pb2+;生理响应;吸附效应
　　Abstract This study explored the effects of Pb2+ on the physiological characteristics of Arthrospira sp. and the adsorption effect of Arthrospira sp. on Pb2+ by measuring the physiological response of Arthrospira sp. under different concentrations of Pb2+.The results showed that Pb2+ had significant effects on the morphological and physiological characteristics of Arthrospira sp..When the concentration of Pb2+ in the water environment was 50 mg/L， it had a significant inhibitory effect on the growth of Arthrospira sp.. The phycobiliprotein， chlorophyll a and carotene content had the lowest value， and the physiological response of phycocyanin to changes in Pb2+ concentration was more sensitive than that of allophycocyanin. The adsorption amount of Arthrospira sp. to Pb2+ was approximately positively correlated with the concentration of Pb2+， but the adsorption amount increased sharply at 30-50 mg/L.The adsorption rate was roughly negatively correlated with the concentration of Pb2+， but the adsorption rate increased sharply at 40 mg/L. It can be seen that when Arthrospira sp. was used as a bioadsorbent for the treatment of heavy metal Pb2+ in wastewater，its adsorption effect had a strong relationship with the physiological state and Pb2+ concentration of Arthrospira sp.. The preliminary study on the adsorption of heavy metal Pb2+ by Arthrospira sp. provide a theoretical basis for the widespread application as bioadsorbent of Arthrospira sp..Key words Arthrospira sp.;Pb2+;Physiological response;Adsorption effect
　　人類活动对生态环境的影响日渐增强，工业的飞速发展使得重金属污染问题愈发严重。重金属类污染物生物毒性显著且难以降解，引入环境后长时间保留[1-3]，在生物链的放大作用下持续地被富集，积蓄于生物体中，不仅威胁人类的健康，而且严重影响各个生物群体的生长与繁殖[4-5]。
　　铅因其抗侵蚀性、高膨胀系数及良好的延展性等，被广泛应用于采矿、航空和涂料等诸多工业领域。含Pb2+的工业废水持续大量排放造成了铅污染范围不断地扩大，铅通过消化道、呼吸道及皮肤进入人体后，主要毒性效应是贫血症、神经机能失调和肾损伤[6]。
　　传统处理水体中Pb2+的方法包括化学和物理法，如化学沉淀法、离子交换法及活性炭吸附法等，这些方法大部分成本较高或者还存在造成二次污染的风险。生物吸附指利用生物本身的特性，通过表面络合、静电吸附或酶促作用等机理来实现分离水体中的重金属离子[7-8]。生物吸附剂根据来源主要分为微生物和农业废弃物。在蓝藻中已发现螺旋藻、鱼腥藻、微囊藻和颤藻等可用于富集水环境中的重金属离子[9-11]。微藻生长繁殖迅速，对于重金属的吸附作用明显且具有选择吸附性，因此具有良好的应用前景。
　　该研究以节旋藻TJSD091藻株为试验材料，测定节旋藻在不同浓度Pb2+胁迫时的生理状态及对Pb2+的吸附特性，评价不同浓度Pb2+对节旋藻生理特性的影响及节旋藻对不同浓度Pb2+的生物吸附和生长耐受能力，以期为应用节旋藻作为水体中重金属铅离子的生物吸附剂提供理论基础。 　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　节旋藻（Arthrospira sp.）TJSD091分离自天津滨海湿地。将藻种按10%比例接种于200 mL AB培养基[12]中，光照12 h（32 ℃）、黑暗12 h（28 ℃）、光照强度3 000 lx培养12 d，每日摇匀3次。
　　1.2 生理指标的测定
　　1.2.1 形态记录。
　　光学显微镜（尼康ECLIPSE Ci-L型）测定节旋藻的细胞宽度、螺径和螺距。
　　1.2.2 浊度测定。
　　紫外分光光度计（HITACHI U-5100型）测定节旋藻藻液OD560 nm。
　　1.2.3 干重测定。
　　取藻液20 mL在已称重的0.45 μm滤膜上抽滤，用蒸馏水清洗，滤膜放入称量瓶中，在70 ℃烘箱中烘至恒重，待冷却至室温后用分析天平称重（SQP型），根据过滤前后滤膜重量差，计算藻细胞的干重。
　　1.2.4 藻胆蛋白浓度的测定。
　　取藻液30 mL过滤，藻泥加入20 mL磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH 6.8）使其重悬浮，-20 ℃放置1 h，反复冻融3次，经超声波细胞粉碎机（Scientz-IID型）破碎5 min，6 000 r/min离心5 min，取上清液测量其OD615 nm和OD652 nm。按公式（1）和（2）计算浓度[13]：
　　1.2.5 叶绿素a浓度的测定。
　　取4 mL藻液8 000 r/min离心30 min，弃上清，加入4 mL无水乙醇，4 ℃放置24 h，5 000 r/min离心30 min，取上清，紫外分光光度计测定OD665 nm和OD649 nm。按公式（3）计算浓度 [14]：
　　1.2.6 类胡萝卜素浓度的测定。
　　取藻液30 mL过滤，藻泥加入20 mL蒸馏水悬浮。反复冻融3次后定容至25 mL并混匀。取2.5 mL节旋藻藻液于50 mL离心管中，加入22.5 mL无水丙酮，避光放置30 min。滤纸过滤，分光光度计测定其OD440 nm、OD644 nm和OD662 nm。按公式（4）计算浓度[15]：
　　1.3 Pb2+吸附试验
　　设置10个Pb2+浓度梯度（10～100）mg/L及对照组（0 mg/L），每组3个重复。Pb2+用蒸馏水配制成100 mg/L的母液，稀硝酸溶液稀释到20、40、60、80和100 mg/L作为标准液绘制标准曲线。在Pb2+胁迫24 h后，按步骤“1.2”测定指标，将“1.2.3”所得滤液通过原子吸收分光光度计（普析通用AFG型），采用氢化物法（苏州流量计有限公司 WHG-630A型）测定其中的铅离子浓度，空白对照溶液为0 mg/L组的滤液。参数设置如下：吸收线波长为283.3 nm，灯电流为2 mA，狭缝宽度为0.4 nm，燃烧器高度为11 mm，乙炔流量为1 500 mL/min。参照标准曲线及样品溶液的吸光度计算Pb2+浓度。按公式（5）、（6）计算[16]：
　　式中，M表示吸附量（mg/g），C0为溶液初始浓度（mg/L），C1为吸附平衡浓度（mg/L），V为溶液体积（L），ms为藻生物量（g），P为吸附率（%）。
　　1.4 数据处理
　　使用SPSS 17.0软件对数据进行ANOVA分析，通过OriginPro 8.0软件绘制统计图。
　　2 結果与分析
　　2.1 形态及干重的变化
　　表1为不同浓度Pb2+处理的节旋藻的形态特征与干重描述。方差分析表明，螺距、螺径、宽度及干重均差异极显著（P<0.01）。当Pb2+浓度处于0～50 mg/L时，藻丝体的螺距变化显著，60～100 mg/L时趋于平缓。螺径在Pb2+浓度为40 mg/L时出现最小值，100 mg/L时又明显下降。Pb2+浓度在20～80 mg/L时细胞宽度明显小于0～10 mg/L时的细胞宽度，但在80～100 mg/L时细胞宽度开始持续增加。节旋藻干重在Pb2+浓度为50 mg/L时有最小值。
　　2.2 生长量变化
　　方差分析表明，不同浓度的Pb2+对节旋藻的生长具有极显著的影响（P<0.01）。从图1可看出，当Pb2+浓度为10 mg/L时节旋藻生长无明显变化，10～30 mg/L时先下降后上升，超过30 mg/L时受到强烈的抑制作用;50 mg/L时达到最低值，这与节旋藻的生长活力有关，同时与节旋藻干重指标的试验结果相符合;之后随着Pb2+浓度的不断升高，其生长也在不断回升并趋于平缓，这可能与藻类在重金属离子胁迫下的保护机制有关[17]。
　　2.3 藻胆蛋白含量的变化
　　方差分析表明，藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白均差异极显著（P<0.01）。从图2可以看出，Pb2+的加入使得藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的浓度显著降低。当Pb2+浓度在10～50 mg/L时，二者的含量在总体上均呈现先下降后上升再下降的过程，均在50 mg/L时达到最低值，说明此时藻体的生理代谢受到强烈的抑制作用;而超过50 mg/L时，二者的含量基本保持不变。这与藻体生长曲线的变化趋势相吻合，且藻蓝蛋白响应Pb2+的胁迫比别藻蓝蛋白更为敏感。
　　2.4 叶绿素a含量的变化
　　方差分析表明，不同浓度的Pb2+对节旋藻叶绿素a含量具有极显著的影响（P<0.01）。从图3可看出，叶绿素a浓度的变化趋势呈现“M”形，当Pb2+浓度为10 mg/L时，叶绿素a含量明显上升，达到最大值;10～50 mg/L时持续下降，于50 mg/L达到最低值;在50～80 mg/L时出现上升，80 mg/L时处于较高值;当超过80 mg/L后又出现直线下降的趋势。 　　2.5 类胡萝卜素含量的变化
　　方差分析表明，不同浓度的Pb2+对节旋藻类胡萝卜素含量具有极显著的影响（P<0.01）。从图4可看出，当Pb2+浓度在0～50 mg/L时，类胡萝卜素含量基本呈持续下降趋势，50 mg/L时处于最小值;超过50 mg/L后明显上升，在60～70 mg/L时又出现下降;在70～90 mg/L时出现上升，但超过90 mg/L后，类胡萝卜素含量又明显下降。
　　2.6 Pb2+的吸附效应
　　以Pb2+浓度（C）为横坐标、Pb2+浓度所对应的吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线，所得标准曲线方程为A=0.053 1C-0.013 9（R2=0.995 6）。
　　从表2可以看出，节旋藻的吸附量和吸附率均差异极显著（P<0.01）。节旋藻对Pb2+的吸附量随着Pb2+浓度的增大基本呈上升趋势，在60～70 mg/L时，其吸附量稍有降低，但随后又上升。而节旋藻对Pb2+的吸附率随着Pb2+浓度的增大大致呈减小趋势，在40 mg/L时，其吸附率突然升高，随后持续降低。
　　3 讨论
　　生物活性细胞吸附重金属离子包含胞外吸附和胞内积累2个过程。胞外吸附主要由位于细胞壁上的基团与金属离子结合而吸附金属[18]，藻类的细胞壁表面皱褶多且多孔，有较大的比表面积，且带有负电荷，可以通过静电吸引、离子交换和络合等方式吸附;胞内积累主要是利用生物体新陈代謝作用产生的能量，通过单价或二价离子转移系统把金属离子输送到胞内后积累于某些细胞器，然后转化为毒性较小的化合物，这是胞内重金属解毒机制。胞内积累为主动吸附，超负荷积累金属离子会抑制酶活、破坏抗氧化系统、增大细胞膜透性使得藻类停止生长[19]。对于藻类吸附金属离子的研究大都处于实验室阶段[20-22]。
　　节旋藻的生长由生长素诱导，其对节旋藻的促生长作用存在最适浓度，较小时效果不明显，较大时出现抑制作用，而Pb2+的存在则会破坏生长素的结构。周长芳等[23]研究发现，当Pb2+浓度小于50 mg/L时促进螺旋藻生长，大于60 mg/L时出现抑制作用。胡一兵等[24]研究发现，当Pb2+浓度超过50 mg/L时对钝顶螺旋藻生长的毒害作用明显。该试验中发现，当Pb2+浓度小于30 mg/L时节旋藻的生长仍然呈上升趋势，达到50 mg/L时，藻体生长到抑制。
　　藻胆蛋白主要包括藻蓝蛋白（PC）和别藻蓝蛋白（APC），作为蓝藻中普遍存在的2种捕光色素蛋白是重要的活性物质，并且在光的传递过程中起着桥梁的作用[25]。Pb2+可透过细胞壁作用于细胞膜，严重破坏细胞膜的透性。节旋藻在Pb2+长时间胁迫条件下细胞膜受到伤害，影响选择透过性，大量的细胞内容物外渗，藻胆蛋白解离溶出[26]。叶绿素含量的降低可能由于Pb2+直接干扰叶绿素的合成，一方面，高浓度的铅离子可以抑制叶绿素合成过程中叶绿素酸酯还原酶的活性，并影响氨基-γ-酮戊酸的合成，二者均为叶绿素合成所必需的前体物质[27-28];另一方面，Pb2+会取代叶绿素分子中的Mg2+或与叶绿体中可溶性蛋白质上的巯基结合，破坏叶绿素的结构和功能[29]。另外，细胞受到Pb2+胁迫后活性氧自由基和叶绿素酶都可能引起光合色素的降解[30]。类胡萝卜素能够清除活性氧自由基，防止脂质过氧化。当藻体细胞遭受Pb2+胁迫时，细胞内的电子传递链受阻，因此导致代谢过程中产生的活性氧自由基发生累积。类胡萝卜素主要发挥抗氧化作用，因此含量不断下降。试验中当Pb2+浓度超过50 mg/L时，类胡萝卜素的含量变化较明显，可能细胞内的抗氧化系统遭到破坏，超出了细胞抵御逆境胁迫的能力，说明高浓度的Pb2+对节旋藻的伤害程度较严重。
　　4 结论
　　当水环境中Pb2+在低浓度（30 mg/L以下）时，Pb2+对节旋藻没有明显的抑制作用，对生长具有微弱的促进作用，但叶绿素a含量起伏较大，类胡萝卜素含量持续下降直至30 mg/L时略有回升。当Pb2+浓度在50 mg/L时，藻胆蛋白、叶绿素a和类胡萝卜素均出现最低值，但吸附量突然升高，吸附率却小于40 mg/L时的吸附率，此时节旋藻生长受到强烈抑制。由于活性微生物吸附剂存在抗性范围[31]，因此这很可能是由于节旋藻对金属离子吸附与吸收超负荷而影响了细胞自身的生理活动，表明其对Pb2+的吸附效应与生理代谢和细胞活动关系密切。当Pb2+浓度在50 mg/L以上时，藻胆蛋白、叶绿素a和类胡萝卜素稍有回升但随着Pb2+浓度增大而低于低浓度Pb2+时的含量，这也表明金属离子对细胞损害的严重性。
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