烟区土壤高效氨化芽孢杆菌菌株的筛选鉴定及特性研究

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　　摘  要：为提高有机肥中有机氮的分解效率，满足烤烟生长前期氮素需求，利用氨化细菌培养基从贵州烟区土壤中分离、纯化获得了5株氨化细菌菌株，通过纳氏试剂比色法测定培养液中的氨氮浓度，5株菌株的氨氮产量在297～460 mg/L之间;筛选出氨化作用最强的2株菌株，通过形态、生理生化特征、16S rRNA基因测序及系统发育分析，鉴定AMM-2菌株为Bacillus toyonensis，AMM-5为Bacillus mobilis。氨化特性研究显示，在pH 7.0的氨化细菌培养基中，30 ℃条件下培养48 h，2株菌产生的NH4+-N浓度分别可达514和505 mg/L，在pH 4.0～10.0和25～30 ℃温度范围内均表现较强的氨化能力，其中AMM-5菌株的温度适应性更广、耐盐性更高。研究获得了分解有机氮能力强的芽孢杆菌菌株，为提高有机肥的肥效提供了菌株资源。
　　关键词：氨化细菌;芽孢杆菌;鉴定;氨化特性
　　Screening， Identification and Ammoniation Features of High Effective Ammonifying Bacillus Strains Isolated from Tobacco-planted Soils
　　LIU Shang， ZHANG Hong， ZHANG Qianshen， GONG Ying， HAN Lizhen*
　　（College of Life Science， Guizhou University， Guiyang 550025， China）
　　Abstract： In order to improve decomposition efficiency of organic nitrogen in organic fertilizer and meet the nitrogen requirement of tobacco at the early growth stage， five ammonifying bacterial strains were isolated and purified from tobacco-planted soil in Guizhou using ammoniated bacterium medium. The NH4+-N concentrations in ammoniated medium of five strains were between 297 mg/L and 460 mg/L by the measurement of Nessler’s reagent method. Two ammonifying strains AMM-2 and AMM-5， with the highest ammonifying ability were identified as Bacillus toyonensis and Bacillus mobilis， respectively， based on the morphological characteristics， physiological and biochemical identification， 16S rRNA gene sequencing and phylogenetic tree analysis. After incubation for 48 h at 30 ℃， the NH4+-N concentrations of AMM-2 and AMM-5 in ammoniated medium （pH 7.0） were 514 mg/L and 505 mg/L ， respectively. Good ammonifying abilities of the two ammonifying strains were observed under the condition of pH 4.0-10.0 and temperature 25-30 ℃， respectively. Comparing with AMM-2， AMM-5 showed the wider temperature adaptation and higher salt tolerance. The two Bacillus strains with high organic nitrogen decomposition ability， obtained in this study could provide desirable strain resources for enhancing manurial effect of organic fertilizer.
　　Keywords： ammonifying bacterium; Bacillus spp.; identification; ammonifying features
　　煙草是我国重要的经济作物，适宜的植烟土壤是优质烟叶生产的关键。施肥是烤烟生产实践中重要的环节，施肥对烟叶产量产值的贡献率可分别达到39.19%和47.28%[1]，但是大量施用化肥会导致土壤结构变差，有机质含量下降，微生物活性降低，从而造成土壤环境恶化[2]。研究报道有机肥可以改善植烟土壤的理化性质及微生态结构，提高土壤肥力和肥料利用率[3]。然而在贵州，植烟土壤一般比较黏重，烤烟生长前期低温多雨，增施有机肥后土壤氮素的生物有效性不高，难以满足烤烟前期生长的需要[4]。如何在降低化肥使用量的同时，提高有机肥氮素的利用效率显得尤为重要。土壤微生物的参与是促进氮素形态转化的重要因素，氨化细菌是土壤氨化作用进行的重要参与者，它可以将土壤中的有机氮分解产生NH3，其活性和数量在一定程度上反映了土壤有效氮和铵态氮的供应能力[5-6]。研究显示烤烟连作土壤中氨化细菌数量减少，有机氮的矿化作用被减弱，土壤供氮能力下降，导致烤烟产量与品质明显下降[7]。为了满足烤烟生长前期对无机氮的需求，可以分离筛选分解有机氮效果较强的微生物菌剂，调控土壤中无机氮的释放[8]。 　　目前对氨化细菌的研究大多集中在不同水体氨化细菌的分离及水体氨氮污染的治理方面，而从土壤中分离筛选氨化细菌的研究报道较少。本项目组前期从贵州植烟土壤中获得多株氨化细菌，室内有机肥培养试验结果表明，部分菌株接种的有机肥中，无机氮含量明显提高[8]。本研究对贵州烟区混合土样中分离获得的5株氨化菌株进行氨化能力的动态监测，从中筛选到2株高效的氨化细菌并进行鉴定，探讨环境因素对菌株氨化能力的影响，为下一步有机氮分解菌剂的制备奠定基础，为施用有机肥后植烟土壤有机氮的分解调控提供理论依据。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　1.1.1  土样采集  于2017年7—8月（烟草旺长期）采集贵州省遵义地区湄潭县抄乐乡、毕节地区威宁县黑石镇烟区黄壤等量混合后，置于4 ℃冰箱保存，用于分离筛选氨化细菌。
　　1.1.2  培养基  LB及氨化细菌培养基参考文献[9]。
　　1.2  方法
　　1.2.1  氨化细菌的分离及初筛  取适量植烟土壤加入无菌生理盐水中振荡混匀后，经梯度稀释和氨化细菌固体培养基平板涂布分离纯化氨化细菌菌株并保存。过夜活化菌株转接入氨化细菌液体培养基中，于30 ℃、120 r/min摇床振荡培养2 d后，取少量培养液加入纳氏试剂定性检测进行初筛。
　　1.2.2  高效氨化细菌菌株的复筛  初筛获得的氨化细菌菌株于氨化细菌液体培养基中，30 ℃条件下摇床振荡培养72 h，每8 h取样1次，测定培养液OD600值;培养液经4000 r/min 离心后，取上清经纳氏试剂分光光度法测定氨氮浓度[10]。
　　1.2.3  高效氨化细菌菌株的鉴定  采用形态及生理生化试验、分子鉴定进行鉴定。以LB琼脂平板划线观察菌落形态、革兰氏染色镜检观察细胞形态进行形态学特征描述，生理生化实验参照文献[11]。
　　分子鉴定通过对菌株的16S rRNA基因测序分析进行。利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株DNA后，以16S rRNA基因通用引物对27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）进行PCR扩增[12]。PCR产物送上海英骏生物工程有限公司测序，测序结果在Ezbiocloud数据库和NCBI上进行相似性序列比对，挑选相似性较高的模式菌株，以MEGA 5.1构建系统发育树。
　　1.2.4  温度对高效氨化細菌菌株氨化能力的影响  设置4个培养温度，分别为25、30、35及40 ℃，将高效氨化细菌菌株接入氨化细菌液体培养基中、不同温度条件下振荡培养48 h，测定培养液中 NH4+-N浓度。
　　1.2.5  pH对高效氨化细菌菌株氨化能力的影响  调节氨化细菌液体培养基pH分别为4.0～10.0，将菌株接入不同pH的氨化培养基中，于30 ℃条件下培养48 h，测定培养液NH4+-N浓度。
　　以上实验均以未接种的氨化细菌培养基为空白对照，对照及实验组均设3个重复。
　　1.3  数据处理
　　试验数据采用Excel 2010和SPSS 20.0软件进行分析，使用Duncan法进行组间差异显著性检验。
　　2  结  果
　　2.1  氨化细菌的分离及初步筛选
　　在氨化细菌固体培养基生长良好的单菌落，经纳氏试剂定性分析，初步筛选出5株具氨化能力的菌株，分别命名为AMM-1、AMM-2、AMM-4、AMM-5、AMM-6。
　　2.2  5株氨化细菌菌株的氨化能力及生长曲线的测定
　　5个菌株产氨氮的能力随着培养时间的延长而逐渐增强，大多数菌株在培养48～64 h之间达到最大值（图1）。不同菌株的氨化能力存在差异，AMM-1和AMM-4菌株32 h培养液的氨氮浓度最高、分别为312和297 mg/L;此时，AMM-6培养液的氨氮含量才开始逐渐增高;菌株AMM-2培养48 h的氨氮含量为413 mg/L，AMM-5菌株64 h培养液中的氨氮含量达460 mg/L，是两株产氨氮能力较强的菌株。
　　菌株在氨化培养基中的生长曲线如图2。AMM-6菌株的生长较缓慢，56 h后由对数期进入稳定生长阶段;而其余4株菌均在培养24 h后进入稳定期。结合不同菌株产氨氮的能力（图1），在对数生长期（24 h以内），AMM-1、AMM-2、AMM-
　　4及AMM-5等4个菌株培养液中的氨氮浓度随着OD600值的升高而快速增加，菌株的氨化能力在此时期表现突出;当进入稳定期后，AMM-2和AMM-5产氨氮量仍在缓慢增长。而对于AMM-6菌株，前期培养过程中虽有菌体的生长，但几乎未检测到氨氮生成，直至32 h后氨氮含量才呈逐渐上升。综合菌体的生长曲线及产氨氮能力，选择AMM-2和AMM-5进一步研究。
　　2.3  高效氨化细菌菌株的鉴定
　　形态学观察表明（图3），菌株AMM-2的菌落为表面粗糙的乳白色不透明状，中心呈点状突起、边缘不规则，镜检为G+的杆状细菌、中生芽孢。AMM-5菌落呈灰白色、不透明的椭圆形，镜检也表现为G+、中生芽孢的杆状细菌。生理生化试验结果（表1）显示，2株菌均具有运动性，V.P.试验及硝酸盐还原阳性，可在5% NaCl浓度下生长;但AMM-2菌株可利用海藻糖、甘油及果糖，而AMM-5菌株在高达7% NaCl环境中生长良好。
　　对16S rRNA基因测序结果进行比对，发现AMM-2、AMM-5与多株Bacillus sp.的相似性较高（表2），选择芽孢杆菌属相关种的模式菌株与这2株菌构建系统发育树（图4），2个菌株分别与相似性最高的模式菌株位于同一发育地位。根据生理生化鉴定结果、参考JIM?NZE等[13]以及LIU等[14]对于芽孢杆菌属不同近似种的鉴定依据，并结合分子鉴定结果，判定AMM-2为Bacillus toyonensis、AMM-5为Bacillus mobilis。 　　2.4  培养温度对2个菌株产氨氮能力的影响
　　如图5所示，当培养温度为30 ℃时，AMM-2的产氨氮能力显著高于其余温度（p<0.05），此时培养液中的氨氮含量为514 mg/L;AMM-5菌株产氨氮最高的温度为30 ℃，但与25 ℃条件下差异不显著。当培养温度为35 ℃时，2菌株培养液中的氨氮浓度分别降低至最适溫度下的20.23%和60.20%，AMM-5菌株产氨氮能力具有更广的温度适应性。
　　2.5  培养液pH对2个菌株产氨氮能力的影响
　　AMM-2和AMM-5菌株在pH 7.0时的产氨氮能力显著高于其余pH条件（p<0.05）;当pH降低至4.0时，两菌株产生的氨氮浓度分别为pH 7.0时的83.66%和90.89%;而pH升高至10.0时的氨氮浓度分别为最适pH时的71.79%和77.62%（图6）。显然，2个菌株的产氨氮能力具有很广的pH适应性。
　　3  讨  论
　　近年来文献报道的氨化细菌主要有芽孢杆菌属（Bacillus sp.）、沙雷氏菌属（Serratia sp.）、产碱杆菌属（Alcaligenes sp.）、肠杆菌属（Enterobacter sp.）等[15]，从不同环境中分离的多个种属的氨化细菌菌株，氨化能力存在一定差异。从茶园土壤分离到的3株氨化菌株分别为芽孢杆菌属、微小杆菌属和不动杆菌属，振荡培养 10 h后的NH4+-N含量分别为141、68和83.5 mg/L[16]。从烟叶中筛选出的嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis）和副短短芽孢杆菌（Brevibacillus parabrevis）菌株，48 h的发酵液中NH4+-N含量为50、56.1和41.9 mg/L[17]。从废硅藻土中筛选出的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌BSD1菌株的氨氮量为232.2 mg/L[18]。与上述报道相比，本研究获得的2株芽孢杆菌菌株具有更强的氨化能力。此外，研究显示pH会影响有机氮的降解能力，低于最适pH时，氨化活性明显降低[9，19]。AMM-2和AMM-5菌株在pH 4.0～10.0范围内均具有较强的氨化能力，该特征使得菌株具有用于高浓度氨氮废水处理的潜力。
　　对5株氨化细菌的生长曲线及氨化能力的动态测定发现，除AMM-6外，其余4株菌产氨氮速度最快的时期是菌株的对数生长期。据报道从餐厨垃圾中分离到的Bacillus amyloliquefaciens DT菌株，对数生长期的OD600值与其氨化活性呈现相关性[20]。类似的结果也被ZHANG等[21]报道，因而，大多数氨化菌株的生长与氨氮的降解是同步进行的。特别的是，AMM-6菌株的氨氮量在对数生长后期（32 h后）才开始明显增高，且稳定期的产氨氮速度高于对数生长期，其原因有待于研究。
　　目前我国烤烟生产中氮素管理主要存在两大问题，一是施氮量过大，易导致烟叶品质下降;二是氮肥施肥基追比与烤烟根系吸氮规律不吻合[22]。合理配施有机肥可以提高烤烟产量和质量[23]。微生物参与下的有机肥分解可以加速无机态氮素的释放速率。氨化过程是氮素矿化（有机氮转化为铵态氮、硝态氮过程）的第一步，也是植物可利用氮素供应的关键一步[24]。本研究从烟区土壤中分离筛选到的2株菌株，具有很强的产氨氮能力，在较广的pH范围内，氨化能力仍可维持一定水平。利用该菌株研发微生物有机肥，可明显提高有机氮的分解速率。此外，芽孢杆菌是一类重要的微生物菌种资源，因其能产生芽孢及促生机制多样性，在生物肥料和生物农药等领域受到广泛关注。国内外报道的植物根际促生菌以芽孢杆菌属占优势，接种试验表明部分菌株有显著提高烟草的株高和鲜重，改善烤烟的农艺性状及烟叶的化学品质，降低烤烟发病率的作用[25-27]。因而，本研究从健康烟草种植土壤获得的2株芽孢杆菌是否具有促生抗病性能，值得进一步研究并挖掘其应用潜力。
　　4  结  论
　　从贵州不同烟区的混合土样中分离到5株氨化细菌，产氨氮浓度在297～460 mg/L之间，通过氨化能力及生长曲线的动态测定，筛选出氨化作用最强的2株菌株;通过形态学、生理生化及分子生物学方法进行鉴定，将AMM-2鉴定为Bacillus toyonensis，AMM-5菌株鉴定为Bacillus mobilis。在pH 7.0氨化细菌培养基中，30 ℃条件下培养48 h，2株菌产生的NH4+-N浓度分别可达514和505 mg/L;在pH 4.0～10.0，温度25～30 ℃范围内均表现较强的氨化能力，但AMM-5菌株的温度适应性更广、耐盐性更高。研究为提高有机肥的肥效提供了菌株资源，对2个菌株是否具有促生功能的探究将有助于拓展其应用的范围。
　　参考文献
　　[1]郑华，石俊雄，樊立辉，等. 菜籽饼与化肥配施对烤烟根际微生物的影响[J]. 中国烟草科学，2009，30（6）：46-48.
　　ZHENG H， SHI J X， FAN L H， et al. Effects of combined application of rapeseed cake and chemical fertilizer on rhizosphere microbes of flue-cured tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2009， 30（6）： 46-48.
　　[2]刘国顺，刘韶松，贾新成，等. 烟田施用有机肥对土壤理化性状和烟叶香气成分含量的影响[J]. 中国烟草科学，2005，11（3）：29-33.
　　LIU G S， LIU S S， JIA X C， et al. Influence of physico-chemical property of soil and the tobacco aroma composition by using organic fertilizer in the tobacco farmland[J]. Chinese Tobacco Science， 2005， 11（3）： 29-33. 　　[3]叶江平，贺方云，吴峰，等. 生物有机肥处理方式与微生物菌群关系研究[J]. 中国烟草科学，2014，35（5）：33-39.
　　YE J P， HE F Y， WU F， et al. Effect of treating approaches on microbial community of bio-organic manure[J]. Chinese Tobacco Scinece， 2014， 35（5）： 33-39.
　　[4]丁美丽. 烟地土壤微生物特性与氮素生物有效性的关系[D]. 贵阳：贵州大学，2006.
　　DING M L. Relation between the soil microbial characteristic and biological availability of nitrogen for tobacco[D]. Guiyang： Guizhou University， 2006.
　　[5]李秀英，赵秉强，李絮花，等. 不同施肥制度对土壤微生物的影响及其与土壤肥力的关系[J]. 中国农业科学，2005，38（8）：1591-1599.
　　LI X Y， ZHAO B Q， LI X H， et al. Effects of different fertilization systems on soil microbe and its relation to soil fertility[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2005， 38（8）： 1591-1599.
　　[6]李喆，元野，马力，等. 不同轮作方式对牡丹江地区烟田土壤微生物数量及分布的影响[J]. 东北林业大学学报，2010，38（7）：96-99.
　　LI Z， YUAN Y， MA L， et al. Effects of different rotations on the amount and distribution of soil microorganisms in Mudanjiang tobacco-cropping areas[J]. Journal of Northeast Forestry University， 2010， 38（7）： 96-99.
　　[7]李鑫，张秀丽，孙冰玉，等. 烤烟连作对耕层土壤酶活性及微生物区系的影响[J]. 土壤，2012，44（3）：456-460.
　　LI X， ZHANG X L， SUN B Y， et al. Effects of continuous cropping in flue-cured tobacco on soil enzyme activities and microbial flora in arable layers of soils[J]. Soils， 2012， 44（3）： 456-460.
　　[8]王小花，黄莺，陈雪，等. 植烟土壤高活性氨化菌的筛选鉴定及其氨化能力分析[J]. 中国烟草科学，2019，40（3）：31-38.
　　WANG X H， HUANG Y， CHEN X， et al. Screening， identification and ammoniation ability analysis of high activity ammonia bacteria in tobacco growing soil[J]. Chinese Tobacco Science， 2019， 40（3）： 31-38.
　　[9]郭端强，方改霞，段敬霞，等. 河南省白龟山水库下游水体氨化细菌分离鉴定及其降解有机氮条件[J]. 微生物学通报，2014，41（2）：236-242.
　　GUO D Q， FANG G X， DUAN J X， et al. Isolation and identification of ammonifying bacteria in the downstream waters of Baiguishan Reservior in Henan Province and conditions of degrading organic nitrogen[J]. Microbiology China， 2014， 41（2）： 236-242.
　　[10]魏复盛. 水和废水监测分析方法[M]. 4版. 北京：中国环境科学出版社，2002：279-285.
　　WEI F S. Water and wastewater monitoring and analysis methods[M]. 4th edition. Beijing： China Environmental Science Press， 2002： 279-285.
　　[11]布坎南R E，吉本斯N E. 伯杰细菌鉴定手册[M]. 8版. 北京：科学出版社，1984：729-758.
　　BUCHANAN R E， GIBBONS N E. Bergey's manual of determinative bacteriology[M]. 8th edition. Beijing： Science Press， Beijing， 1984： 729-758.
　　[12]王歡，韩丽珍. 4株茶树根际促生菌菌株的鉴定及促生作用[J]. 微生物学通报，2019，46（3）：548-562.
　　WANG H， HAN L Z. Identification of four plant growth-promoting rhizobacteria isolated from tea rhizosphere[J]. Microbiology China， 2019， 46（3）： 548-562. 　　[13]JIM?NEZ G， URDIAIN M， CIFUENTES A， et al. Description of Bacillus toyonensis sp. nov.， a novel species of the Bacillus cereus group， and pairwise genome comparisons of the species of the group by means of ANI calculations[J]. Systematic and Applied Microbiology， 2013， 36（6）： 383-391.
　　[14]LIU Y， DU J， LAI Q， et al. Corrigendum： Proposal of nine novel species of the Bacillus cereus group[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2018， 68（8）： 2499-2508.
　　[15]张庆华，戴习林，李怡，等. 凡纳滨对虾养殖池水中的氨化细菌鉴定及系统发育分析[J]. 水产学报，2007，31（5）：692-698.
　　ZHANG Q H， DAI X L， LI Y， et al. Identification and phylogenesis of ammonifying bacteria from pond water of Litopenaeus vannamei [J]. Journal of Fisheries of China， 2007， 31（5）： 692-698.
　　[16]韩晓阳，李智，汪强强，等. 茶园土壤高活性氨化菌的筛选鉴定及特性研究[J]. 茶叶科学，2013，33（1）：91-98.
　　HAN X Y， LI Z， WANG Q Q， et al. Research on screening and identification of ammonifying bacterium and characteristic of strains from the soils of tea garden[J]. Journal of Tea Science， 2013， 33（1）： 91-98.
　　[17]周家喜，张晓敏，胡大鸣，等. 陈化烟叶中氨化细菌鉴定及有机氮降解特性[J]. 生态学杂志，2016，35（11）：3005-3011.
　　ZHOU J X， ZHANG X M， HU D M， et al. Isolation and identification of ammonifying bacteria in the flue-cured tobacco and characteristics of degrading organic nitrogen[J]. Chinese Joumal of Ecology， 2016， 35（11）： 3005-3011.
　　[18]GONG X， TIAN W， BAI J， et al. Highly efficient deproteinization with an ammonifying bacteria Lysinibacillus fusiformis isolated from brewery spent diatomite[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering， 2019， 127（3）： 326-332.
　　[19]张文艺，李秋艳，赵婷婷，等. BAF反应器中氨化细菌的筛选与氨化特性分析[J]. 环境工程学报，2011，5（12）：2890-2894.
　　ZHANG W Y， LI Q Y， ZHAO T T， et al. Isolation of amonifying bacteria from BAF reactor and analysis on amination characterization[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering， 2011， 5（12）： 2890-2894.
　　[20]CAI H， RAN W， HUI J， et al. Characterization of the ammonification， the relevant protease production and activity in a high-efficiency ammonifier Bacillus amyloliquefaciens DT[J]. International Biodeterioration and Biodegradation， 2019， 142： 11-17.
　　[21]ZHANG W Y， TAN F Y， ZHAO T T， et al. Isolation and identification of ammonibacteria and ammoniation characteristic analysis[J]. Advanced Materials Research， 2011， 340： 280-286.
　　[22]丁效東，闫慧峰，张士荣，等. 有机肥C/N优化下氮肥运筹对烟株根际无机氮和酶活性的影响[J]. 中国烟草科学，2016，37（1）：26-31.
　　DING X D， YAN H F， ZHANG S R， et al. The effect of nitrogen management on Nmin and enzyme activities in rhizosphere soil of flue-cured tobacco under the optimization of C/N with organic fertilizer[J]. Chinese Tobacco Science， 2016， 37（1）： 26-31. 　　[23]滕桂香，邱慧珍，张春红，等. 微生物有机肥对烤烟育苗、产量和品质的影响[J]. 中国生态农业学报，2011，19（6）：1255-1260.
　　TENG G X， QIU H Z， ZHANG C H， et al. Effect of microbial organic fertilizer on seedling growth，yield and quality of flue-cured tobacco[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture， 2011， 19（6）： 1255-1260.
　　[24]赵彤，蒋跃利，闫浩，等. 土壤氨化过程中微生物作用研究进展[J]. 应用与环境生物学报，2014，20（2）：315-321.
　　ZHAO T， JIANG Y L， YAN H， et al. Research advances on microbial function in soil ammonifying process[J]. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology， 2014， 20（2）： 315-321.
　　[25]黄智华，崔永和，计思贵，等. 云南烤烟根际土壤PGPR菌株的筛选与鉴定[J]. 中国烟草科学，2017，38（5）：18-23.
　　HUANG Z H， CUI Y H， JI S G， et al. Isolation and identification of PGPR strains from rhizosphere soil of Yunnan flue-cured tobacco[J]. Chinese Tobacco Science， 2017， 38（5）： 18-23.
　　[26]马欣， 刘俊， 乔俊卿， 等. 利用转座子TnYLB-1构建枯草芽孢杆菌的突變体文库[J]. 南京农业大学学报，2011，34（6）：77-81.
　　MA X， LIU J， QIAO J Q， et al. Construction of transposition insertion library of Bacillus subtilis by using transposon TnYLB-1[J]. Journal of Nanjing Agricultural University， 2011， 34（6）： 77-81.
　　[27]谢雨歆， 曾庆宾， 杨军伟， 等. 植物根际促生细菌在烤烟提质增产中的作用[J]. 烟草科技，2017，50（7）：14-21，30.
　　XIE Y X， ZENG Q B， YANG J W， et al. Effects of growth-promoting rhizobacteria on quality and yield of flue-curedtobacco[J]. Tobacco Science and Technology， 2017， 50（7）： 14-21， 30.
　　基金项目：贵州省烟草公司科技项目“原位氮代谢功能菌肥研发与运用”（201707）;贵州大学SRT计划项目“氮代谢功能菌的筛选及发酵条件的优化”{贵大SRT字[2017]110号}
　　作者简介：刘  尚（1999-），男，本科生，研究方向：土壤微生物学。E-mail：liushang222@qq.com。*通信作者，E-mail：hanlizhen11@163.com.
　　收稿日期：2019-08-25                    修回日期：2019-11-08
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