?苏云金芽孢杆菌筛选及其对蚊科幼虫的杀虫活性?

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　　摘 要：从四川剑阁、湖北天门、湖南吉首等地采集了100份土样，通过高温法进行苏云金芽孢杆菌的分离纯化，采用PCR法对菌株的杀虫基因进行鉴定，以期筛选对蚊科幼虫有杀虫活力的苏云金芽孢杆菌菌株，并以蚊科幼虫孑孓为材料对筛选菌株的杀虫活性进行了鉴定。 结果表明：100份土样中共筛选到20个苏云金芽孢杆菌菌株，其中7个菌株含有以蚊科幼虫为靶标的杀虫基因;其中S4-2菌株的杀虫活性最高，在伴孢晶体浓度为2.00 mg/mL时，校正死亡率为96.67%。
　　关键词：苏云金芽孢杆菌;蚊科幼虫;菌株鉴定;基因型;杀虫活性
　　中图分类号：S476+9 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2020）02-0049-04
　　Abstract： One hundred soil samples were collected from Jiange of Sichuan Province， Tianmen of Hubei Province and Jishou of Hunan Province. Bacillus thuringiensis was isolated and purified by high temperature method. The insecticidal gene of Bacillus thuringiensis was identified by PCR method in order to screen Bacillus thuringiensis strains with insecticidal activity to mosquito larvae， and the insecticidal activity of the screened strains was evaluated by using mosquito larvae as material. The results show that 20 Bacillus thuringiensis strains are screened from 100 soil samples， 7 of which contain insecticidal genes targeting mosquito larvae; among them， S4-2 strain has the highest insecticidal activity， and at the concentration of parasporal crystal of 2.00 mg/mL， the corrected mortality is 96.67%.
　　Key words： Bacillus thuringiensis; mosquito larva; strain identification; genotype; insecticidal activity
　　苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是一种全球广泛存在的革兰氏阳性细菌，可产芽孢和由不同的cry基因编码的伴孢晶体（cry protein）[1-2]。
　　苏云金芽孢杆菌产品具有对人类无毒害，对环境无污染且对靶标害虫高效的特点，在农业领域得到了广泛的应用[3]。目前，发现并克隆的杀虫Bt基因已超过300 种，分别对鳞翅（Lepidoptera）、双翅目（Diptera）、鞘翅目（Coleoptera）、膜翅目（Hymenoptera）、同翅目（Homoptera）、直翅目（Orthoptera）、食毛目（Mallophaga）等昆虫具有殺虫活性[4]。自1901年发现以来，苏云金芽孢杆菌受到世界各国的普遍关注，已成为研究最深入、应用最广泛的生物杀虫剂[5]。苏云金芽孢杆菌的最适生长温度为24～28℃，除了温度以外，阳光辐射、pH值等对其田间作用效果的稳定性有较大影响[6]。而太阳辐射为较难控制的环境因素，因此该因素也成为限制苏云金芽孢杆菌活性的最主要因素。由于Bt制剂杀虫谱窄，毒效较化学药剂低，加上某些害虫对Bt制剂已产生抗性等原因[7]，Bt制剂的发展受到一定限制。近年来，各国纷纷加大研发力度，以期通过Bt菌株分离鉴定、δ-内毒素组成研究和cry基因型鉴定分类等手段筛选出新型、高效的杀虫菌株和特异性基因。
　　双翅目蚊科昆虫是常见的卫生害虫之一，人类许多疾病都可通过蚊科昆虫传播，如登革热、疟疾、黄热病、丝虫病、日本脑炎等[8]。根据世界卫生组织的统计，全球每年有 3亿～5亿疟疾的病例，死亡300万～500万人;每年登革热的病例有数千万，在我国每年疟疾的报告病例为3万～5万[9]。而目前还没有疫苗和有效的药物来预防疟疾和登革热，且在除南极洲外，世界各大洲均有蚊虫分布，因此必须控制媒介蚊虫的数量来阻断蚊媒病的暴发和流行，降低其对人类的危害[10]。目前，对蚊虫的防治主要是针对成虫，多用蚊香、灭蚊喷剂及电蚊拍等灭蚊。但长期使用蚊香和灭蚊喷剂对人体有一定的危害。此外，因为蚊香使用不当造成的火灾事故年年都有发生。因此，探寻消灭蚊类幼虫的方法更为可取。
　　Bt生物农药在防治鳞翅目昆虫方面已取得了显著成效，但关于其对双翅目昆虫的防效研究相对较少[11]。苏云金芽孢杆菌对双翅目昆虫具有毒杀作用，且其伴孢晶体多为球形，也鉴定了多个杀虫cry基因，这为苏云金芽孢杆菌防治双翅目昆虫的菌株筛选奠定了良好的基础[12]。试验从四川剑阁、湖北天门、湖南吉首等地采集了100份土样，通过高温法进行苏云金芽孢杆菌的分离纯化，采用PCR法对菌株的杀虫基因进行鉴定，以期筛选对蚊科幼虫有杀虫活力的苏云金芽孢杆菌菌株，并以蚊科幼虫孑孓为材料对筛选菌株的杀虫活性进行了鉴定。
　　1 材料与方法
　　1.1 土样采集与菌株分离
　　从四川剑阁、湖北天门、湖南吉首等地采集土样共计100份。具体采样方法为：选取无农事操作土地，去掉5 cm深的表层土壤;用无菌药勺采集5 g土样装于无菌采样袋中[13];将土样带回实验室于4℃冰箱中保存备用。菌株分离方法为：取1 g土样悬浮于10 mL无菌水中，65 ℃水浴加热30 min，震荡混匀;吸取10 μL溶液，稀释100倍;取100 μL稀释液，加入900 μL无菌水稀释成1 000倍稀释液;分别吸取10 μL的100倍稀释液和1 000倍稀释液，涂布在NA培养基[14]上，置于30℃培养箱培养2～3 d;挑取菌落在显微镜下观察，标记呈苏云金芽孢杆菌菌落形状的菌落;将标记菌落进行纯化，将纯化菌落置于4℃冰箱保存备用。 　　1.2 供试昆虫
　　供试蚊科幼虫孑孓饲养于长江大学西校区植物园固定水桶内。试验时先用小号塑料水桶舀取固定水桶内含孑孓的水，然后用纱布分离，再用小毛笔将纱布上获得的孑孓置于新的小桶内水中，小桶内加有少许酵母粉进行饲养[15]。
　　1.3 伴孢晶体观察及收集
　　伴孢晶体观察：取一干净载玻片，滴一滴清水;取出保存的菌株，用无菌枪头挑取菌落于载玻片上的水滴中，用枪头将菌体在水滴之中涂布均匀，置于烘箱中烘干;用移液枪吸取100 μL石碳酸，滴在有菌体部分，静置染色1 min左右;用无菌水冲洗滴有石碳酸复红染液的玻片3～4次，用纸巾擦干菌株以外的水渍，盖上盖玻片，做成苏云金芽孢杆菌玻片;在100倍油镜下观察苏云金芽孢杆菌及其伴孢晶体，判断苏云金芽孢杆菌类型，并拍照[16]。
　　伴孢晶体收集：将纯化的苏云金芽孢杆菌菌株接种至装有50 mL LB 培养液的离心管中，220 r/min，30 ℃培养48～72 h;待菌株产生大量伴孢晶体后，将培养好的菌液放入离心机，4 500 r/min，4℃冷冻离心20 min，弃上清;用20 mL 0.1% Triton-x100生理盐水重悬菌体，重悬菌液，4 500 r/min，4 ℃离心20 min，弃上清;无菌水洗涤沉淀3次，低温风干后称量沉淀物重量;加入一定量无菌水，配置成固定浓度的悬浮液，4℃保存备用。
　　1.4 苏云金芽孢杆菌基因型的鉴定
　　采用PCR的方法对分离出来的苏云金芽孢杆菌菌株进行基因型鉴定，鉴定中所用cry1、cry2、cry4等引物是根据文献[17]设计。反应条件：94℃ 5 min;94℃ 1 min，退火1 min，72℃1 min，35个循环;72℃10 min。其中，根据不同引物设定不同退火温度。
　　1.5 伴孢晶体对蚊科幼虫的杀虫活性鉴定
　　（1）初步筛选。取100 mL灭菌锥形瓶，向其中加入一定量苏云金芽孢杆菌晶体悬浮液，对照组加入等量无菌水，然后向锥形瓶中加入饲养幼虫水体，定容至50 mL，配制成晶体浓度为1 mg/mL的溶液，每个菌株设3组平行。在饲养的幼虫中选择3～4龄幼虫，用小毛笔挑至锥形瓶中，每个锥形瓶中10只，用封口膜将锥形瓶封口。记录幼虫接入时间，于第二日相同时间统计死亡幼虫及存活幼虫数量，共统计5 d，记录其总存活数，死亡数量。
　　（2）复筛。挑选初步筛选中表现出的高毒菌株，按照上述步骤进行不同浓度的杀虫性试验。
　　2 结果与分析
　　2.1 菌株筛选结果
　　經过分离筛选，从100份土样中共获得苏云金芽孢杆菌菌株20株，筛选率为20%。其中，从四川剑阁筛选出苏云金芽孢杆菌8株，从湖北天门筛选出苏云金芽孢杆菌6株，从湖南石首筛选出苏云金芽孢杆菌6株，其对应地点和编号见表2。
　　2.2 伴孢晶体的形态观察
　　将分离出来的菌株经石碳酸复红染色后在光学显微镜（10×目镜，100×油镜）下进行观察，镜检结果如图1所示，菌株包含的伴孢晶体类型均为圆球形（图1B），从而可初步判断它们可能对双翅目蚊科幼虫具有杀虫活性。
　　2.3 Bt菌株cry 基因型的鉴定
　　cry1、cry2和cry4是对双翅目昆虫具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌的主要杀虫基因，故可采用PCR方法对所筛选的苏云金芽孢杆菌菌株的基因型进行鉴定。由图2可知，从获得的苏云金芽孢杆菌中分离出含cry1基因的苏云金芽孢杆菌3株，分别为S4-1、S20-1、HB8-1;含cry2基因的苏云金芽孢菌株2株，为HB2-1和HN10-1;含cry4基因的苏云金菌株4株，分别为S4-1和S4-2和S12-1、HN10-1。
　　2.4 毒力菌株的初步筛选
　　利用饲养的双翅目蚊科3～4龄幼虫对分离的20株苏云金芽孢杆菌菌株伴孢晶体进行杀虫生物活性测定，结果如表3所示，对蚊科幼虫有杀虫作用的菌株共计3株，分别为S4-2、S12-1、HN10-1;其中杀虫效果最好的是S4-2，在1.00 mg/mL 浓度下校正死亡率为82.76%，差异达到显著水平。
　　2.5 高毒菌株的复筛
　　选择初步筛选中表现出显著杀虫活性的S4-2菌株和表现出一定杀虫活性的S12-1、HN10-1菌株进行了不同晶体浓度的梯度杀虫试验，结果如表4所示，S4-2菌株在伴孢晶体浓度为2.00 mg/mL时杀虫活性最强，校正死亡率达到96.67%，差异达到显著水平，而同浓度的S12-1、HN10-1菌株，校正死亡率分别只有53.33%和63.33%，杀虫效果较差，可能需要更高的浓度才能获得较好的效果。
　　3 讨 论
　　高效杀虫活性的苏云金芽孢杆菌的筛选是一项长期不懈的任务。该研究从四川剑阁、湖北天门、湖南吉首3地采集土样100份，共筛选苏云金芽孢杆菌菌株20株，筛选率只有50%。不同地方的土样，因为其地理环境及土壤酸碱性等生化特性不同，含有的苏云金芽孢杆菌菌株种类与数量存在差异。相较于四川剑阁和湖南吉首采集的土样，湖北天门采集到的土样中分离出的苏云金芽孢杆菌菌株种类数量相对较少。剑阁、吉首都为山区，天门属于江汉平原，与大洪山区毗邻，自然环境的差异导致山区与平原地区的苏云金芽孢杆菌菌株内所含基因及其对不同目科昆虫的防治效果存在一定差异[18]。在分离出的20株苏云金芽孢杆菌中，含cry1基因的菌株有3株，含cry2基因的菌株有2株，含cry4基因的有4株。理论上含有cry4基因的苏云金杆菌对双翅目昆虫有较强的毒杀作用，但试验结果显示，各菌株的具体毒力强弱存在差异[19]。
　　对20株苏云金芽孢杆菌菌株进行蚊科幼虫杀虫试验，筛选出一株杀虫活性相对较高的菌株S4-2，当伴孢晶体浓度为2.00 mg/mL时，对蚊科幼虫孑孓的校正死亡率高达96.67%。但是，笔者只进行了室内试验，与蚊虫类幼虫生活环境存在一定的差异，故该菌株对蚊科幼虫的防治在理论上是可行的。户外使用该种苏云金芽孢杆菌是否会产生室内同样的效果，尚需进一步验证。试验选择的蚊科幼虫对象为孑孓的3～4龄，该龄期孑孓可能相较于其低龄幼虫有较高的抗药性，故在低龄幼虫期进行蚊科幼虫的防治，应有更好的防治效果。此外，按蚊属、伊蚊属和摇蚊属蚊科幼虫在自然界中多混合生活于水中，而该试验所选择的对象为蚊科的幼虫，并未区分是按蚊、伊蚊还是摇蚊的幼虫[20]。有研究表明，不同属种的蚊类幼虫在不同环境条件下对苏云金芽孢杆菌的响应存在一定的差异，但该研究的试验条件与自然条件十分接近，因此其结果更具参考价值。 　　苏云金芽孢杆菌作为生物杀虫剂相对于化学农药有许多优点，如对人畜安全无害、对环境无污染等。此外，蚊科昆虫主要通过成虫传播各种疾病，若能将蚊科昆虫消灭于幼虫，必将大大减少人类疾病的传播与发生。如果能得到一种高效的防蚊苏云金芽孢杆菌菌株，必将大大减少蚊虫给人们带来的危害。因此，不断加强苏云金芽孢杆菌菌株的筛选，积极探索其对蚊类幼虫的杀虫活性，具有十分重要的现实意义。
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　　（责任编辑：成 平）
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