解淀粉芽孢杆菌Y11产淀粉的酶条件优化

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　　摘要：为了提高解淀粉芽孢杆菌Y11的产淀粉酶能力，研究了其培养基成分（碳源、氮源、无机盐），及发酵培养条件（温度、pH值、接种量）对产生淀粉酶活的影响，通过单因素试验、Box-Behnken 响应面分析试验、正交试验，以酶活为响应值，确定了微生物培养的最佳培养基成分及最佳培养条件。结果表明，培养基成分及培养条件的改变可以显著提高酶活，得到解淀粉芽孢杆菌的最佳培养基组成如下：淀粉16.29 g/L，酵母膏16.04 g/L，MgSO4 0.42 g/L；最佳培养条件为培养温度35 ℃，pH 值7，接种量1.5%，得到最高酶活为70.2 U/mL，较初始发酵培养酶活提高1.8倍。
　　关键词：解淀粉芽孢杆菌；液体发酵；淀粉酶；条件优化；酶活
　　中图分类号：TQ920.9 文献标志码：A doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2019.05.046
　　Abstract：In order to improve the amylase-producing ability of Bacillus amylolytica Y11，the effects of its medium components（carbon，nitrogen，inorganic salt）and fermentation conditions（temperature，pH，inoculation amount）on the amylase-producing activity were studied. Through single factor experiment，Box-Behnken response surface analysis experiment and orthogonal experiment，with enzyme activity as the response value，the optimum medium composition and culture conditions of microbial culture were determined. The results showed that the enzyme activity of Bacillus amylolytica could be significantly increased by changing the composition of the medium and the culture conditions. The optimum medium for producing Bacillus amylolytica was starch 16.29 g/L，yeast extract 16.04 g/L，MgSO4 0.42 g/L. The optimum culture conditions were culture temperature 35 ℃，pH 7，inoculation 1.5%，and the highest enzyme activity 70.2 U/mL. Compared with the initial fermentation，the enzyme activity increased by 1.8 times.
　　Key words：Bacillus amylus；liquid fermentation；amylase；condition optimization；enzyme activity
　　淀粉是煙草生长过程中积累的重要碳水化合物，广泛存在于烟草的茎叶中[1]，淀粉在烟叶细胞中的合成、积累、分解、转化状况，决定着烤后叶片内部各种化学成分之间的协调程度，影响着烟叶品质[2]。淀粉含量过高会影响燃烧速度和燃烧的完全性，产生焦煳气味，对烟气产生不良影响[3]。然而，淀粉经降解可转化为小分子碳水化合物，对烟气有积极作用，并且促进香味物质的生成，可改善抽吸品质[4]。目前，我国调制后烟叶淀粉含量偏高，是制约我国烟支品质的重要因素[5]。据了解，国内主要通过烟草育种、栽培、调制和醇化等方面来改善烟叶品质[6]。新鲜烟叶淀粉含量达到40%左右，经过卷烟加工，优质烤烟烟叶淀粉含量为1%～2%，但是对于等级较低的烟叶，经过卷烟加工后，淀粉含量依然偏高。大量研究表明，烟叶淀粉的大量降解主要是在烟叶初烤、复烤和烟叶陈化过程中，其中微生物的降解发挥着重要的作用[7]。但是烟叶中存在的微生物是有限的，依据烟叶中存在的微生物，很难使烟叶中淀粉降解到优质烤烟的要求[7]。
　　因此，现在利用外加酶及微生物来降解烟叶淀粉成为烟草行业研究的热点。试验以前期从烟叶表面筛选出的降解淀粉的解淀粉芽孢杆菌Y11为研究对象，对其产酶条件进行优化，以淀粉酶酶活为响应值，最终得到其最佳培养基成分及发酵条件。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与试剂
　　菌株，由前期试验，从烟叶中筛选出1株可以高效降解淀粉的菌株，通过形态观察、生理生化试验和分子鉴定等手段，鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌；葡萄糖、可溶性淀粉、玉米粉、蔗糖，以及（NH4）2SO4，MgSO4，CaCl2，FeSO4，K2PO4，天津市凯通化学试剂有限公司提供；酵母膏、蛋白胨、尿素等，北京奥博星生物技术责任公司提供；DNS试剂：称取5 g的3，5 -二硝基水杨酸，边搅拌边加入到300 mL的去离子水中，缓慢加入5 g NaOH，在50 ℃水浴锅中水浴加热、搅拌溶解，然后加入100 g酒石酸钾钠，1 g苯酚和2.5 g的无水亚硫酸钠，搅拌溶解澄清后冷却至室温、用水定容至500 mL，贮藏在棕色试剂瓶中，在黑暗处放置1周以上使用。
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　　1.2.1 培养方法
　　种子培养：挑取菌株单菌落接种到50 mL种子培养液中，培养至OD值为2.0～2.5，得种子液，将种子液放置4 ℃冰箱中备用。
　　初始培养基：葡萄糖10 g，蛋白胨5.0 g，酵母膏5.0 g，氯化钠10.0 g，1 000 mL，于121 ℃，20 min条件下灭菌。
　　发酵培养：取种子液1 mL接种于100 mL发酵培养基中，在37 ℃，200 r/min条件下发酵培养40 h。
　　1.2.2 淀粉酶活的测定方法
　　将发酵液高速离心（4 ℃，10 000 r/min，10 min），液体即为粗酶液。取1 mL粗酶液，加入到1 mL， 5 g/L的可溶性淀粉溶液中，酶解时间20 min，加 0.5 mol/L盐酸溶液1 mL 混合均匀，加3 mL DNS试剂，沸水处理反应5 min，然后稀释到25 mL，测吸光度，计算酶活。对照为灭活的酶液，按照上诉操作。定义1 h酶解淀粉产生1 mg葡糖糖的酶量为一个酶活为 1 U，单位为U/mL。
　　酶活=葡糖糖含量×N（60/n）.
　　式中：n——酶解时间；
　　N——粗酶液稀释倍数。
　　1.2.3 葡萄糖标准曲线的绘制
　　精确称取葡萄糖0.10 g，溶解到蒸馏水中，加水定容至100 mL，将溶液配置为质量浓度1.00 g/L的葡萄糖溶液，分别取0，2，4，6，8，10标准溶液定容至50 mL容量瓶中，即为质量浓度0，0.04， 0.08，0.12，0.16，0.20， 0.24 g/L的标准溶液，分别取2 mL加入3 mL DNS，沸水浴反应5 min，冷却后，以去离子水做空白对照校正，用紫外分光光度计于波长550 nm处测吸光度A。
　　1.2.4 菌株的培养基成分的优化
　　（1）碳源试验。在初始培养基的基础上，氮源为蛋白胨10 g/L，酵母5 g/L，无机盐为NaCl 5 g/L，分别以10 g/L玉米粉、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖为碳源，酶活为响应值，得出最佳碳源，再考查最佳碳源量对酶活的影响，分别取最佳碳源量5，10， 15，20，25 g/L，于37 ℃，200 r/min条件下发酵培养40 h，测产生淀粉酶活性。
　　（2）氮源试验。在初始培养基的基础上，以淀粉质量浓度为15 g/L，分别以10 g/L蛋白胨、（NH4）2SO4、酵母膏、尿素为氮源，测定酶活性，再对最佳氮源的添加量进行优化，其质量浓度分别为5，10， 15， 20，25 g/L，发酵条件及测定方法同上。
　　（3）无机盐试验。在初始培养基的基础上，碳源为可溶性淀粉15 g/L，氮源为酵母膏15 g/L，分别以0.3 g/L K2HPO4，CaCL2，MgSO4，FeSO4作为无机盐，再对最佳无机盐的添加量进行优化，其质量浓度为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 g/L，发酵条件及测定方法同上。
　　1.2.5 响应面分析试验
　　采用Design Expert 8.0.6.1软件对培养基成分分析进行Box-Behnken响应面设计，在单因素试验的基础上，对碳源（淀粉）、氮源（酵母膏）、无机盐（MgSO4）三因素各设计3个水平。
　　Box-Behnken试验设计因素水平见表1。
　　1.2.6 发酵培养条件优化
　　（1）培养温度的优化。在最佳培养基的基础 上，分别在20，25，30，35，40 ℃下，在转速 200 r/min，pH值7，接种量1%条件下，培养40 h 后，测定淀粉酶活性，考查温度对酶活的影响。
　　（2）pH值的优化。设置pH值5.0，6.0，7.0， 8.0，在培养温度35 ℃，转速200 r/min，接种量1%条件下，培养40 h 后，测定淀粉酶活性，考查pH值对酶活的影响。
　　（3）接种量的优化。设置接种量0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，在pH 值7.0，培养温度35 ℃，在转速200 r/min，培养40 h条件下，测定淀粉酶活性，考查不同接种量对酶活的影响。
　　（4）正交试验。在单因素水平的基础上，再对温度、接种量、pH值3个因素进行正交试验设计，各设置3个不同的水平，进一步确定菌株产酶的最优条件，采用L9（34）正交表进行试验。
　　正交试验因素与水平设计见表2。
　　1.3 数据分析
　　数据均用3次平行试验的平均值表示，响应面分析试验应用Design Expert软件中的RSREG（Response Surface Regression）程序进行响应面回归计算，并对回归方程进行方差分析和系数显著性检验。正交试验采用SPSS 17.0分析软件，对正交数据进行极差及方差分析。试验数据采用Origin 9.1作图。
　　2 结果与分析
　　2.1 葡萄糖标准曲线绘制
　　按照DNS方法测定
　　葡萄糖的标准曲线见图1。
　　根据标准曲线可知，吸光度与葡萄糖质量浓度的回归方程为Y=1.785 89X-0.011 54，相关系数R2=0.997 91，表明在0～0.3 g/L质量浓度范围内，葡萄糖质量浓度与吸光度A线性关系良好。
　　2.2 初始发酵条件下菌株产酶动力学
　　菌株的发酵曲线见图2。
　　由图2可知，菌体浓度及菌株产酶能力均随着发酵时间先增大后减少，且二者呈现极显著关系，菌株在发酵40 h时，产生淀粉酶达到最大；发酵时间大于40 h后，产淀粉酶酶活性下降，因此選择 40 h为最佳发酵产酶时间，进行培养基成分及培养条件的优化。
　　2.3 培养基成分优化 　　2.3.1 碳源单因素试验
　　培养基中的碳源是构成菌体细胞和代谢产物的主要元素，又为微生物生命活动提供能量。同时还能作为菌株产生淀粉酶的诱导底物。选用淀粉、葡萄糖、蔗糖、玉米粉作为碳源进行优化，并对最佳碳源的量进行优化。
　　不同碳源对酶活的影响见图3，淀粉质量浓度对酶活的影响见图4。
　　由图3可知，淀粉作为碳源时，酶活最高，这可能是因为淀粉酶在有淀粉诱导下更有利于淀粉酶的产生，因此选择淀粉作为碳源。由图4可知，淀粉量为15 g/L时，酶活最高。
　　2.3.2 氮源单因素试验
　　氮源是组成菌体细胞和代谢产物的必需营养物质，培养基中使用的氮源一般分为无机和有机2种氮源。选择尿素、蛋白胨、酵母膏及硫酸铵为碳源，考查其对酶活的影响。
　　不同氮源对酶活的影响见图5，酵母膏质量浓度对酶活的影响见图6。
　　由图5可知，酵母膏作为氮源，酶活性最高，而无机氮NH4SO4作为氮源时，酶活性最低，说明无机氮源不利于该菌株产生淀粉酶。因此，选择酵母膏作为最佳氮源，再对其质量浓度进行优化。由图6可知，酵母添加量在一定范围内可促进淀粉酶的产生，超出这一范围会不利于菌株的产酶，酵母膏质量浓度为15 g/L时，酶活最高。
　　2.3.3 无机盐单因素试验
　　无机盐在细胞中的含量虽然不多，但是生命活动所必需的，其主要功能是参与构成菌体成分，作为酶的组成部分，维持酶的活性或调解渗透压等。无机盐含量不足或者过高时，菌株生长都会受到抑制，导致产酶能力下降。
　　不同无机盐对酶活的影响见图7，硫酸镁质量浓度对酶活的影响见图8。
　　由图6可知，MgSO4作为无机盐时酶活性最高，图7是MgSO4质量浓度的优化。由图7可知，MgSO4质量浓度为0.4 g/L时，酶活最高。
　　2.3.4 响应面分析试验
　　响应面试验设计与结果见表3，回归模型方差分析见表4。
　　利用Design Expert软件，对表3数据结果进行方差分析和模型的显著性分析，结果见表4。对响应面试验的响应值进行多元二次回归拟合，得到回归模型方程为：
　　酶活= 59.20+3.61A+3.21B+1.30C-0.97AB+
　　2.25AC-1.80BC-7.06A2-6.66B2-7.09C2.
　　由表4可知，该模型p=0.000 1<0.010 0，说明回归模型可信度高。通过R2来判断该模型的拟合度，R2=0.970 8，表明有97.08%的试验数据可用此模型进行解释，进一步说明回归方程的拟合程度较好。
　　该模型的拟合度回归方程各项方差分析表明，一次项A（淀粉）、B（酵母膏）对酶活影响是非常显著的，C（MgSO4）对其酶活影响不显著，二次项A2，B2，C2的影响是极显著，但其交互作用AB，AC，BC是不显著的，说明各具体试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系；由F值判断，在选择范围内，3个因素对淀粉酶活的影响顺序为A>B>C。
　　2.3.5 响应曲面图分析
　　各因素交互作用对酶活影响的响应曲面图见图9。
　　通过Design Expert 软件对3个试验因素分别两两交互，做出响应曲面图。由图9可知，淀粉与MgSO4对酶活的交互作用最强，其次是酵母膏与MgSO4，而淀粉与MgSO4的交互作用最弱。同时影响酶活最显著的因素是淀粉，表现为其响应面弧度变化最大，其次是酵母膏和MgSO4。
　　应用Design Expert软件得到培养基的最佳配方为淀粉质量浓度16.29 g/L，酵母膏质量浓度16.04 g/L，MgSO4质量浓度0.42 g/L，此时酶活为60.069 6 U/mL，并对其进行3次试验验证，得到酶活为60.11 U/mL，与理论值基本吻合，说明该回归方程能比较真实地反映各因素对产生酶活的影响。
　　2.3.6 培养条件优化结果
　　（1）培养温度优化的结果。
　　培养温度对酶活的影响见图10。
　　微生物在不同的生长温度下，生长速率不同，在适合的温度下微生物生长周期缩短，产酶量增多，因此找到微生物的最适产酶温度，对于提高酶活性具有重要的意义[8]。由图10可知，在温度20～35 ℃，随着温度的上升，酶活性逐渐提高；到达35 ℃后，随着温度的上升，酶活性开始下降，因此解淀粉芽孢杆菌Y11的最佳发酵温度是35 ℃。
　　（2）培养pH值的优化结果。
　　初始pH值对酶活的影响见图11。
　　培养基的pH值会影响菌体的形态和代谢产物的合成途径，从而影响菌体的产酶能力。图11是初始pH值对酶活影响的结果，从图11中可以看出，该菌株的最佳发酵pH值为7.0。
　　（3）培养接种量的优化结果。
　　接种量对酶活的影响见图12。
　　由图12可以看出，接种量在0.5%～1.5%时，酶活性随着接种量的增加而增加，接种量为1.5%时，酶活性达到最大值，当接种量大于1.5%，酶活性随着接种量的增加而减少。因此，选择接种量为1.5%作为最佳接种量。
　　（4）正交试验优化结果。
　　正交试验设计与结果分析见表5，正交设计方差分析结果见表6。
　　采用正交试验对菌株的发酵温度、pH值、接种量进行优化，选出最佳组合。通过表6中p值可以看出，B '（pH值）、A'（温度）对酶活影响是显著的，而接种量在1%～2%的范围内对酶活影响是不显著的。由表5數据极差分析，可知因素主次顺序为 B '>A'>C '。因素B '，即培养初始pH值对酶活影响最大，是极显著的；因素C '，即接种量对酶活的影响最小，得到最佳培养条件为A'2B '2C '2，即培养温度35 ℃，pH 值7，接种量1.5%，经过3次平行试验得酶活为70.2 U/mL。
　　3 结论
　　通过单因素试验、响应面试验及正交试验对解淀粉芽孢杆菌Y11液体发酵产生淀粉酶的培养基成分及发酵培养条件进行优化，得到最佳培养基成分为淀粉质量浓度16.29 g/L，酵母膏质量浓度16.04 g/L，MgSO4质量浓度0.42 g/L，最佳培养条件为培养温度35 ℃，pH 值7，接种量1.5%，得到酶活为70.2 U/mL，初始培养条件下酶活25.2 U/mL，优化后酶活提高了1.8倍。试验的解淀粉芽孢杆菌Y11在经过条件优化后，产淀粉酶能力显著提升，在烟草本源微生物产淀粉酶能力中处于较高的产酶水平，对于微生物降解烟叶中的淀粉具有重要的意义。
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