污染土壤的微生物修复研究进展
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摘 要：微生物对污染土壤的修复作用研究日益重要，微生物修复是指利用天然存在的或所培养的功能微生物群，在适宜环境条件下，促进或强化微生物代谢功能，从而达到降低有毒污染物活性或降解成无毒物质的生物修复技术。本文综述了污染土壤的微生物修复机理和影响微生物修复的环境条件以及对石油污染、化学农药污染、重金属污染的土壤微生物修复和采矿废弃地生态恢复的研究进展，同时，结合当前土壤污染的新特点对微生物修复技术进行预测和展望，指出了需要进一步研究的领域。
关键词：污染土壤 微生物修复 修复机理
土壤污染已经成为全球性的重要环境问题之一，对于土壤污染处理而言，传统物理及化学修复技术的最大弊端是污染物去除不彻底，导致二次污的发生，从而带来一定程度的环境健康风险危害。而生物修复技术主要是利用生物有机体，尤其是微生物的降解作用将污染物分解并最终去除，具有快速，安全，费用低廉的优点。因此．被称为环境友好替代技术[1]。利用微生物对不同污染类型土壤进行生物修复已经成为微生物研究的热点之一，学者们努力研究微生物菌种以及生物修复条件[2-3]。以下分别对石油污染、化学农药污染、重金属污染的土壤微生物修复和采矿废弃地生态恢复的研究进展进行综述。
一、微生物修复概念及原理
1.微生物修复概念
微生物修复是指利用天然存在的或所培养的功能微生物群，在适宜环境条件下，促进或强化微生物代谢功能，从而达到降低有毒污染物活性或降解成无毒物质的生物修复技术。微生物修复的实质是生物降解，即微生物对物质(特别是环境污染物)的分解作用。它与传统的分解在本质上是一样的，但又有分解作用所没有的新特征(如共代谢作用、降解质粒等)，因此可视为是分解作用的扩展和延伸[4]。由于微生物个体小、繁殖快、适应性强、易变异，所以可随环境变化产生新的自发突变株，也可能通过形成诱导酶产生新的酶系，具备新的代谢功能以适应新的环境，从而降解和转化那些“陌生”的化合物微生物对土壤中的有毒污染物的降解主要包括氧化反应、还原反应、水解反应和聚合反应等。
首次记录实际使用生物修复是在1972年，于美国宾夕法尼亚州的Ambler清除管线泄露的汽油。1989年，美国阿拉斯加海域受到大面积石油污染以后才首次大规模应用生物修复技术[5]。除美国外，欧洲各国、加拿大等在生物修复方面也有很大的发展。
2.可用于生物修复的微生物类群
根据来源不同可以把起作用的微生物分为3类：土著微生物，外来微生物和基因工程菌(GEM)[6]。目前在实际的生物修复工程中应用的大多是土著微生物，土著微生物无论在数量上还是在降解潜力上都是巨大的。当土著微生物由于种种原因不能用来作为修复污染土壤菌种时，就需要在污染的土壤中接种一些高效的外来微生物。实验表明，在实验条件下，30℃时每克土壤接种10个PCP降解菌，可以使PCP的半衰期(T1/2)从2周降到l天。近年来，由于生物工程技术的飞速发展，构建更高效的修复污染土壤的基因工程菌引起了人们极大的兴趣。目前生物修复正朝着构建能够快速降解某些特定污染物的工程菌的方向发展，科学家利用基因工程把不同的降解基因移植到同一菌株中，创造出了具有多种降解功能的超级微生物[7]。
3.微生物修复的机理
微生物修复污染的土壤必须具备2个方面的条件：一是土壤中存在着多种多样的微生物，这些微生物能够适应变化了的环境，具有或产生酶，具备代谢功能，能够转化或降解土壤中难降解的有机化合物，能够转化或固定土壤中的重金属；二是进入土壤的有机化合物大部分具有可生物降解性，即在微生物的作用下由大分子化合物转变为简单小分子化合物的可能性，进入土壤的重金属具有微生物转化或固定的可能性[8]。只有具备了上述2方面的条件，微生物修复才有实现的可能。
受污染的土壤中有机物和重金属除小部分是通过物理、化学作用被稀释、扩散、挥发及氧化、还原、中和而迁移转化外，主要是通过微生物的作用将其降解转化和固定的，因此，在生物修复中首先应考虑适宜微生物的来源。其次，微生物的代谢活动需在适宜的环境条件下才能进行，而受有机物和重金属污染土壤的条件往往较为恶劣，因此我们必须人为提供合适的环境条件以强化微生物对污染土壤的修复作用。
二、影响微生物修复的环境因素
1.营养
微生物的生长需要维持一定量的C：N：P比例，需要多种营养物质及某些微量营养元素。许多研究者[9-10]对微生物修复的最佳生态条件建议指出，C：N：P最佳比值为100：10：1。在环境胁迫下，微生物维持生存可能需要更多的能量。如重金属可引起脱氢酶活性下降，脱氢酶活性与土壤有机碳之比可作为确定向重金属污染的土壤中添加营养的重要参考指标。
2.电子受体
微生物氧化还原反应的最终电子受体包括溶解氧、有机物分解的中问产物和无机酸根(如硫酸根、硝酸根和碳酸根等)。土壤中污染物氧化分解的最终电子受体的种类和浓度极大地影响微生物作用的速度和程度。研究表明，好氧条件有利于大多数有机物和重金属污染物的微生物降解和转化。充分的氧气供给是微生物修复重要的一环[11]。受污染的土壤中的溶解氧(DO)往往会消耗殆尽，造成缺氧环境，而不利于好氧微生物的降解和转化作用。许多研究者[12-13]对微生物修复的最佳生态条件建议指出：在单因子实验条件下，氧代谢最适水平为溶解氧>0.2mg／L和10％最低空气填充孔隙空间，厌氧代谢最适水平包括O2。的体积百分数<1％。
3.电子供体
大量基质的降解需要有电子受体的充分供应。当被修复主体的溶氧耗尽时，必须采取人工供氧的办法以增加电子供体――氧气。此外，在紧急情况下也可向污染环境中投加双氧水，过氧化钙等产氧剂以及添加硝酸盐、硫酸盐类电子受体，它们都能暂时改变环境中的厌氧生境以发挥好氧微生物对污染物的氧化分解作用。
4.共代谢基质
微生物不能依靠某种有机物生长不一定意味着这种污染物能够抵抗微生物的攻击，因此当存在其他底物时，这种污染物就会通过共代谢(Cometabolism)作用而生物降解。所谓共代谢是指某些难降解的有机化合物，通过微生物的作用能被改变化学结构，但并不能被用作碳源和能源，微生物必须从其他底物获取大部或全部的碳源和能源。许多微生物都有共代谢的能力，各种各样的底物都可能被利用，其降解反应可能涉及除氧化作用外的各种反应。资料表明[9]，在厌氧条件下，DDT的降解过程也经受了共代谢作用过程，其共代谢转化产物可被好氧微生物降解。
三、微生物修复技术类型
原位修复不需要将土壤挖走，直接向污染土壤中投加N、P等营养物质和供氧。这种方法不仅操作简单、成本低、而且不破坏植物生长所需要的土壤环境，污染物氧化安全、无二次污染、处理效果好，是一种高效、经济和生态可承受的清洁技术。原位修复的主要方法有投菌法、生物通气法、生物培养法等。投菌法是直接向污染土壤中投入高效降解菌，同时提供微生物生长所需的营养。生物培养法是定期向土壤中投加过氧化氢和营养物，满足土壤微生物的代谢，将污染物充分矿化成二氧化碳和水。以上两种方法在生物修复中实际应用较多，尤其在重金属、石油、农药污染土壤的微生物修复方面已有一定的应用，但需要借人大量外源菌才能迅速开始生物降解。生物通气法是在污染的土壤上打上几口深井，安装鼓风机和抽真空机，将空气强行排人土壤中，然后抽出，土壤中的挥发性有机物就随之去除了。在通入空气时，加入一定量的氨气，可为土壤中的降解菌提供所需要的氮源，提高微生物的活性，增加去除效率。该方法可应用在石油污染的土壤上，为土壤中的微生物提供充足的电子受体，强化对石油污染物的氧化降解作用。
异位修复是把污染土壤挖出进行集中生物降解。它的方法主要有预制床法、堆制法及生物反应器法等。预制床法是在平台上铺上沙子和石子，将污染的土壤以15cm～30cm厚度平铺在上，并加入营养液和水，必要时加入表面活性剂，定期翻动充氧，以满足土壤微生物对氧的需求，处理过程中流出的渗滤液，即时回灌于土层上，以彻底清除污染物。该方法在PCP、杂酚油、石油、农药等污染土壤的修复中已获得了一些成功的案例。堆制法是将污染土壤与有机废弃物(如木屑、秸秆、树叶)、粪便等混合起来，使用机械或压力系统充氧，同时加入石灰以调节pH值，经过一段时间依靠堆肥过程中的微生物作用来降解土壤中有机污染物。生物反应器法是把污染的土壤移到生物反应器，加水混合成泥浆，调节适宜的pH值，同时加入一定量的营养物质和表面活性剂，底部鼓人空气充氧，满足微生物所需氧气的同时，使微生物与污染物充分接触，加速污染物的降解。该方法的修复效率较高，但它的处理成本也相对较高。
四、几种受污染土壤的微生物修复
1.受农药污染土壤的微生物修复
随着农业的发展，农民使用农药的量越来越多，由此而造成的危害也越来越大。据统计，中国每年使用50多万吨农药。这些农药主要包括杀虫剂、杀菌剂和除草剂等，多是有机氯、有机磷、有机氮、有机硫农药，这些农药对土壤硝化作用呼吸作用和固氮作用均会产生暂时的或永久性的影响，因为在施用农药时，不管采取什么方式大部分农药都会落入土壤中，同时附着在作物上的那一部分农药以及漂浮在空气中的农药也会因风吹落人土壤。另外，使用浸种、拌种等施药方式更是将农药直接混入到土壤中，所以，土壤中的农药污染是相当严重的，已引起土壤生产力和农产品质量的明显下降。实验证明，环境中农药的清除主要靠细菌、放线菌、真菌等微生物的作用。如DDT可被芽孢杆菌属、棒杆菌属、诺卡氏菌属等降解；五氯硝基苯可被链霉菌属，诺卡氏菌属等降解；敌百虫可被曲霉、青霉等降解。残留于土壤内的农药，经过种种复杂的转化、分解，最终将农药分解为二氧化碳和水。如果将土壤进行高压灭菌或采用抑菌剂处理，农药在土壤中的降解速度就会降低、甚至停止。研究表明，在未经消毒的土壤中，除草剂“敌草隆”的降解速度明显高于用熏蒸消毒的土壤。前者，6周内敌草隆降解近半；后者，仅降解1／10。微生物降解农药的方式有2种，一种是以农药作为唯一碳源和能源，或作为唯一的氮源物质，此类农药能很快被微生物降解，如除草剂一氟乐灵，它可作为曲霉属的唯一碳源，所以很易被分解；另一种是通过共代谢作用，共代谢指微生物利用营养基质的同时将污染物分解代谢成无害物质，从而达到降解目的。其具体表现为：(1)依靠环境提供营养物质。例如，只有在蛋白质类物质存在时，直肠梭菌才能降解666；(2)依靠其它微生物的协同作用。例如，链霉菌和节杆菌可协作降解农药二嗪农的嘧啶环，两菌单独存在则均不能作用；(3)需有诱导物存在。如，只有经正庚烷诱导后，铜绿假单胞菌才能产生羟基化酶，使链烷羟基化为相应的醇。再如，放线菌浅灰链霉菌在磺酰脲类除草剂存在的情况下，也可产生诱导性的共代谢，发生羟基化，去烷基化或去酯化反应。进一步对脱细胞提取液进行研究发现，放线菌浅灰链霉菌脱细胞提取液是依靠NAD(P)H进行磺酰脲类代谢，结果表明在浅灰链霉菌中存在着诱导性的、依赖细胞色素P。的磺酰脲代谢系统。在磺酰脲类除草剂存在下，放线菌浅灰链霉菌细胞中可溶性细胞色素P的量大大提高，这是由于一种主要的P4。形态出现，这种形态的P4在用除草剂处理过后，数量增加，而且水解酶活性也加强[14]。
2.受重金属污染土壤的微生物修复
随着工农业的迅速发展，每年有大量工业和城市垃圾作为有机肥进入农业土壤中。这些垃圾往往含有较多的重金属元素，如汞、铜、锌、镍、铅、铬等，这些金属离子作为微量元素是。生物代谢所必需的，然而超过一定浓度时，便会导致土壤微生物大量下降和活性降低，尤其对土壤中有益微生物如自生固氮菌等影响更为明显。所以，重金属污染已日益成为威胁人类健康的、影响人类生活质量的一种全球性的环境公害。重金属对人的毒性作用常与它的存在状态有密切的关系。一般地说，金属存在形式不同，其毒性作用也不同。微生物可以对土壤中的重金属进行固定、移动或转化，改变它们在土壤中的环境化学行为，可促进有毒、有害物质解毒或降低毒性，从而达到生物修复的目的。重金属污染土壤的微生物修复原理主要包括生物富集(如生物积累、生物吸着)和生物转化(如生物氧化还原、甲基化与去甲基化以及重金属的溶解和有机络合配位降解)。研究表明，许多微生物，包括细菌、真菌和藻类可以生物积累和生物吸着环境中的多种重金属。一些微生物，如动胶菌、蓝细菌、硫酸盐还原菌以及某些藻类，能够产生胞外聚合物如多糖、糖蛋白等具有大量的阴离子基团，与重金属离子形成络合物。如，Bargagli在Hg矿附近土壤中分离得到很多高级真菌，一些菌根种和所有腐殖质分解菌都能积累Hg达到100 mg／kg土壤干重。汞所造成的污染最早受到关注汞的微生物转化主要包括三个方面：无机汞的甲基化；无机汞还原成Hg-；甲基汞和其它有机汞化合物裂解并还原成Hg-。包括梭菌、脉孢菌假单胞菌等和许多真菌在内的微生物具有甲基化汞的能力。能使无机汞和有机汞转化为单质汞的微生物有铜绿假单胞菌、金黄色葡萄糖菌、大肠埃希氏菌等。微生物对其它重金属也具有转化能力，硒、铅锡、镉、砷、铝、镁、钯、金、铊也可以甲基化转化。还有研究表明，土壤中分布着多种可以使铬酸盐和重铬酸盐还原的微生物，如产碱菌属、芽孢杆菌属、棒杆菌属、肠杆菌属、假单胞菌属和微球菌属等，这些菌能将高毒性的Cr6+转化为低毒性的Cr3+[15]。
3.受石油污染土壤的微生物修复
烃类化合物包括烷烃、烯烃、炔烃、苯、甲苯、二甲苯等多种复杂芳香烃，是石油的主要组成成分，是重要的工业原料，同时又是燃料与能源。因为这些物质(尤其是多环芳烃)能够致癌、致基因突变、致畸，所以在石油的开采、运输、贮藏和加工过程中，由于意外事故或管理不当，排放到农田、地下水后，往往也会造成土壤的污染，影响土壤的通透性、降低土壤质量、阻碍植物根系的呼吸与吸收、破坏植被，从而直接影响人类的生产和生活。许多学者就石油污染物(尤其是烃类化合物)的微生物代谢机制进行了研究。从烃类污染土壤的生物处理系统中分离到的各类优势微生物均具有解脂酶活性，有解脂酶活性的菌株，就有降解石油烃的能力。添加优势真菌，可以提高生物处理烃类污染土壤的效果。在受烃类污染的土壤中，利用石油烃为碳源的细菌较多，真菌数量较少。细菌虽数量较多，但类群没有真菌丰富。细菌以革兰氏阴性杆菌为优势，其中以动胶菌属为主，其次是黄杆菌属，革兰氏阳性杆菌以芽孢杆菌为主。真菌以毛霉菌属，小克银汉菌属占优势，其次是镰刀菌属、青霉菌属、曲霉菌属，酵母菌属最弱。放线菌以链霉菌为优势[16-17]。真菌和细菌降解石油烃类化合物可形成具有不同立体构型的中间产物。真菌将石油烃类化合物降解成反式二醇，而细菌几乎总是将之降解为顺式二醇[18]。
4.矿山修复地的修复
矿山废弃地是指在采矿活动中所破坏的未经一定处理而尢法使用的土地。十壤结构破坏，养分流失，植被丧失是矿山废弃地的共同特征，尾矿厂的废渣、酸性废水及矸石堆自然产生的大气污染是周围环境的严重污染源，因此对矿山废弃地进行土壤改良和生态恢复就显得十分重要[19]。在废弃地系统中，植物可利形态的氮素来源干有机质的分解、土壤中氮微生物的固氮作用以及降雨中的NO3和NH3。束文圣等的研究表明根瘤菌对锌的耐性最大，其ECl0值和EC50 (Effective concentraiton to reduce by l0％and50％)最高，分别超过300 mg／L和600 mg／L[20]。
矿藏开采、冶炼厂等使用后的土地的复垦与再利用一直比较困难，闪为这类土地不但污染严重，而且土壤的团粒结构和理化性质都发生了很大变化，根本不适于作物生长。但菌根可在修复该类土壤中发挥特殊作用。NoydRK等把菌根真菌根内球囊霉(Glomusintraradices)；匠明球囊霉(Glomusclaroideum)接种到牧草，成功地恢复了矿渣地的植被，达到了修复和复垦的目的。韩桂云等在霍林河露天煤矿脆弱生态地带的生态修复中，应用菌根生物技术，发现供试的菌根菌剂中OIOA和B菌剂对贫瘠和渗透率低的土壤条件表现出较强的调控能力。泥岩氯化对其理化条件虽能有所改善，但氯和磷聚集使幼成活时间甚短[21]。
五、结语与展望
从目前来看，微生物修复是最具发展和应用前景的生物修复技术，人们在微生物材料、降解途径以及修复技术研发等方面取得了一定的研究进展，并展示了一些成功的修复案例。但是针对复杂的污染土壤生态系统，每种微生物修复技术不仅要克服自身原有的不足，而且还需要进一步认识和解决在修复过程中出现的新现象和新问题。如：引入外源微生物的条件与原则问题；生物修复过程中微生物的适应性机制与影响因素的研究问题；有机污染物降解过程中的次生污染物问题等。还有，今后还需在以下几个方面展开深入研究：如，继续筛选和驯化新的降解菌株；进一步解析典型污染物降解基因的结构、功能与调控机制，阐明降解过程的分子生物学机理；解决复合污染土壤的修复问题；利用土地翻耕、农艺措施、添加物质、高效微生物、植物修复、季节更替等创造现场的修复条件构建出一套合理可行的污染土壤田问修复工程技术等等。总之，相信随着科学的发展，大规模利用微生物降解土壤污染物、治理环境污染不久将会成为现实。
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