真方白丸胶囊质量标准研究

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　　摘要：目的 采用多指标综合评价的方法，为真方白丸胶囊提供质量控制的方法和依据。方法 采用薄层色谱法（TLC）对制剂中的天麻、枳壳进行定性研究;采用高效液相色谱法（HPLC）测定真方白丸胶囊中天麻素的含量;采用紫外分光光度法测定真方白丸胶囊中总胆酸的含量。结果 薄层色谱斑点清晰，阴性对照无干扰，天麻素在0.13～2.60μg（r=0.9999），鹅去氧胆酸在0～0.167μg（r=0.9999）范围内线性关系良好，平均回收率分别为99.98%，99.57%，RSD分别为0.202%（n=9）、2.890%（n=6）。结论 该方法简便、灵敏度高、重复性好，能用于该制剂的质量控制。
　　关键词：真方白丸胶囊;总胆酸;天麻素
　　中图分类号：R927 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2019）01-0066-04
　　真方白丸为元代《瑞竹堂方》所裁，主要药物有川乌头、白附子、半夏、天南星、天麻、全蝎等，主治中风病之半身不遂，于明代中叶失传[1-2]。目前，该方被发掘出来后即受到学术界的普遍重视，已成为治疗中风急性期中经络的一个主要方剂。现根据方中药物特性，已将其制备成真方白丸胶囊，为保证该制剂的质量可控性和稳定性，本实验参考《中国药典》（2015年版一部）对制剂中的天麻，枳壳等进行了薄层定性鉴别，采用高效液相色谱法对君药天麻有效成分天麻素测定了含量，采用紫外分光光度法测定了制剂中的总胆酸的含量，并进行方法学研究。
　　1 仪器与材料
　　胆南星（购自内江良辉药业有限公司，）FA2004型电子天平（上海安亭电子仪器厂）;ZDHW调温电热套（北京中兴伟业仪器有限公司）;紫外分光光度计;恒温水浴锅;鹅去氧胆酸对照品（中国药品生物制品检定所）;天麻素对照品（中国药品生物制品检定所），橙皮苷对照品（中国药品生物制品检定所）。所用试剂均为分析纯，水为纯化水。
　　2 方法与结果
　　2.1 天麻素含量测定方法的建立
　　2.1.1 色谱条件 美国赛分 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;以乙腈：0.05%磷酸（3：97）为流动相;流速为1 mL/min;检测波长为220 nm，进样量为10 μL;柱温30℃[3-5]。
　　2.1.2 溶液的制备 供试品溶液制备：取真方白丸胶囊10粒，取出内容物，精密称取混合粉末0.8 g，精密加入25 mL稀乙醇，称定，超声处理30 min后再次称定，用稀乙醇补足减失的重量，过滤，精密量取续滤液10 mL，水浴蒸干，残渣用流动相溶解并定容至25 mL，即得。
　　对照品溶液制备：精密称取天麻素对照品6.5 mg，置于50 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀;即得对照品溶液。
　　阴性对照品溶液：按处方量比例称取除天麻外的混合药粉，按照供试品溶液制备的方法，制备缺天麻的阴性对照溶液。
　　2.1.3 专属性实验 分别精密吸取天麻素对照品溶液，供试品溶液，缺天麻阴性对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件检测。结果对照品溶液和供试品溶液在相同的保留时间均有出峰，阴性对照无干扰。说明该测定方法专属性强，无干扰。
　　2.1.4 线性范围考察 精密称取天麻素对照品适量，用甲醇稀释制成含天麻素对照品0.0130 mg/mL～0.2600 mg/mL的溶液，在上述色谱条件下，分别取混合对照品溶液10μL注入液相色谱仪测定峰面积，以进样量x为横坐标，峰面积y为纵坐标，进行线性回归，得回归方程：y=1381.8x+0.0536（r=0.9999）。结果表明：天麻素在0.13-2.60 μg内，进样量与峰面积呈良好的线性关系。
　　2.1.5 精密度实验 吸取2.1.2项下样品溶液适量，重复测定6次，结果天麻素峰面积的RSD值为1.64%，表明该方法精密度良好。
　　2.1.6 稳定性实验 精密量取2.1.2项下混合对照品溶液，在0，2，4，6和8h分别进样10 μL，记录峰面积，计算RSD为0.73%，结果表明天麻素在8 h内稳定。
　　2.1.7 重复性实验 取同一批样品6份，照2.1.2项下方法制备供试品溶液，依照上述色谱条件平行操作测定，记录峰面积，计算含量。结果RSD值小于1.0%，表明本方法的重复性良好。
　　2.1.8 耐用性实验 取同一批样品，照2.1.2项下方法制备供试品溶液，改变色谱柱温度±5℃、流动相比例±5%，流速±2%，进行耐用性試验。结果RSD<3.0%，说明本方法稳定。
　　2.1.9 加样回收率实验 精密量取已知天麻素含量的样品0.3 g，共9份，分别置于具塞锥形瓶中，每份按高、中、低浓度加入对照品。照2.1.2项下方法制备供试品溶液，依照上述色谱条件平行操作测定，记录峰面积，计算回收率，结果RSD<3.0%，说明加样回收率好。结果见表1。
　　2.1.10 含量测定 取3批真方白丸胶囊，依法制备供试品液并测定天麻素的含量。3批真方白丸胶囊天麻素平均含量为3.32mg·g-1。
　　2.2 UV法测定总胆酸含量
　　2.2.1 溶液的制备 对照品溶液：取鹅去氧胆酸对照品5.02 mg置10 mL量瓶中，用冰乙酸溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品储备液。分别精密移取对照品储备液适量至10 mL量瓶中，加冰乙酸稀释至刻度，制成50.2 μg·mL-1和2.51 μg·mL-1的对照品溶液[6-8]。
　　供试品溶液：取真方白丸胶囊0.4 g，置锥形瓶中，加入10 mL乙酸乙酯，水浴加热回流150 min，加入0.6 g活性炭，再加热回流30 min，过滤，蒸干，残渣加60%冰乙酸溶液溶解并稀释至10 mL，取1 mL稀释液加入14 mL 50%硫酸溶液，摇匀后于75℃水浴10 min，立即冰浴2 min，即得。 　　2.2.2 标准曲线的制备 分别精密吸取0，1.0，2.0，3.0，4.0，4.5，5.0 mL的鹅去氧胆酸对照品溶液（C=0.0502 mg·mL-1）置试管中，以60%冰乙酸溶液作为空白，于377 nm处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，对照品浓度C为横坐标，制作标准曲线，得回归方程A=0.0223C-7x10-6，r=0.9999。结果表明鹅去氧胆酸在0～0.01673 mg·mL-1范围内线性关系良好。
　　2.2.3 精密度实验 精密称取真方白丸胶囊药粉0.4 g，照供试品溶液项下方法制备，以60%冰乙酸为空白对照溶液，于377nm处测定，重复操作6次，RSD为0.45%，表明仪器精密度好。
　　2.2.4 重复性实验 精密称取真方白丸胶囊0.4 g，共6份，照供试品溶液项下方法处理并测定吸光度。计算得到总胆酸平均含量为0.0174 mg·g-1，RSD为2.59%，表明该方法的重复性良好。
　　2.2.5 稳定性实验 取2.2.3项下其中一份样品，分别于0，0.5，1，1.5，3，6 h测定其吸光度，RSD为2.35%，表明样品溶液在6小时内测定基本稳定。
　　2.2.6 准确度实验 精密称取真方白丸胶囊0.2 g，6份，分别加入鹅去氧胆酸对照品溶液（C=2.51μg·mL-1）1 mL，照供试品溶液制备方法操作，于377nm处测定其吸收度，结果平均值为99.57%，RSD为2.89%。
　　2.2.7 样品含量测定 取3批真方白丸胶囊，照2.2.1项下供试品制备方法制备并测定总胆酸含量。3批真方白丸胶囊总胆酸平均含量为0.0174 mg·g-1。
　　2.3 定性鉴别
　　2.3.1 天麻薄层鉴别 取供试品1 g，加25 mL甲醇超声处理30 min，过滤，取续滤液浓缩至1 mL作为供试品溶液。另取缺天麻阴性样品1 g，照上述方法制成阴性对照溶液。精密称取天麻素对照品5.0 mg，加甲醇定容至5 mL作为对照品溶液[9]。照薄层色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0502）试验，吸取上述溶液各3μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（9：1：0.2）为展开剂，展开10 cm，取出，晾干，喷以10%磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热5 min。阴性对照无干扰。
　　2.3.2 枳壳薄层鉴别 取2.3.1项下供试品溶液作为样品溶液;另取缺枳壳阴性样品5 g，照2.1.2项下同法制成阴性对照溶液;精密称取橙皮苷对照品5.0 mg，加甲醇定容至10 mL作为对照品溶液[10]。照薄层色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0502）试验，吸取上述溶液各3μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（4：2：0.15：5）的上层溶液为展开剂，展开10 cm，取出，晾干，喷以3%Alcl3乙醇溶液，在105℃加热5min，置紫外灯（365nm）下检视。阴性对照无干扰。
　　3 讨论
　　3.1 含量测定成分的选择 在进行含量测定时，最初同时测定了天麻素和对羟基苯甲醇的含量，但由于对羟基苯甲醇的含量太低（小于0.05%），因此最后只测定了天麻素的含量。同时为了更好的控制真方白丸胶囊的质量，采用紫外分光光度法测定总胆酸的含量[11]。
　　3.2 HPLC含量测定样品的制备 本实验比较了稀乙醇，乙醇，甲醇，发现稀乙醇的提取效率高，杂质少。比较了超声法和回流提取法，发现前者提取效率高，提取液易于过滤。比较了提取时间，发现超声30 min时提取最彻底。因此，供试品最佳制备方法为以稀乙醇为提取溶剂，超声30 min[12]。
　　3.3色谱柱的选择 按照《中国药典》2015版一部要求，天麻药材含量测定的流动相为乙腈：0.05%磷酸（3：97），为高比例水相，在最初进行含量测定时，选择的是普通安捷伦C18柱，结果后来发现保留时间越来越短，理论塔板数也在降低，考虑到可能是高水相比例对色谱柱的损伤，因此重新选择美国赛分HP-C18柱，保留时间和理论塔板数都保持在合理范围之内[13]。
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