油酰乙醇胺对糖尿病大鼠脑内炎性因子及神经相关因子表达的影响

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　　[摘要] 目的 探讨油酰乙醇胺（OEA）对糖尿病小鼠脑内炎性和神经营养因子的影响。方法 采用高脂高糖加STZ链脲佐菌素（STZ）诱导T2DM小鼠模型，OEA[15、30、60 mg/（kg·d）]连续腹腔注射给药6周，通过Real time-PCR及Western blot检测海马内白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、突触成长相关蛋白-43（GAP-43）、突触素（SYN）、BDNF和NT-3的mRNA和蛋白表达水平。结果 糖尿病模型小鼠海马内炎症因子IL-6、IL-1β和TNFα的表达水平下降，并显著上调海马内GAP-43、SYN、BDNF和NT3 mRNA表达水平。结论 OEA具有降低糖尿病后海马内炎症，增加海马内突触相关因子和神经营养因子的作用，从而发挥神经保护作用。
　　[关键词] 油酰乙醇胺;糖尿病脑损害;海马;神经保护
　　[中图分类号] R961          [文献标识码] A          [文章编号] 1672-4062（2020）01（a）-0015-03
　　
　　Effects of Oleoylethanolamine on the Expression of Inflammatory Factors and Neuro-related Factors in the Brain of Diabetic Rats
　　LIU Jin-feng1， XU Dong-wei1， WANG You-juan1， YANG Wu-shuang2
　　1.Department of Pharmacy， Xiamen Hospital of Traditional Chinese Medicine， Xiamen， Fujian Province， 361009 China; 2.Department of Neurosurgery， Xiamen Hospital of Traditional Chinese Medicine， Xiamen， Fujian Province， 361009 China
　　[Abstract] Objective To investigate the effects of oleoylethanolamine（OEA） on inflammatory and neurotrophic factors in the brain of diabetic mice. Methods T2DM mouse model was induced by high-fat， high-glucose and STZ streptozotocin （STZ）， OEA[15， 30， 60 mg/（kg·d）] was administered by intraperitoneal injection for 6 weeks， through Real time-PCR and Western blot analysis of interleukin-6 （IL-6）， interleukin-1β （IL-1β）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， synaptic growth-related protein-43 （GAP-43）， mRNA and protein expression levels of synaptophysin （SYN）， BDNF and NT-3. Results The expression levels of inflammatory cytokines IL-6， IL-1β and TNFα in hippocampus of diabetic mice decreased， and the expression levels of GAP-43， SYN， BDNF and NT3 mRNA in hippocampus were significantly up-regulated. Conclusion OEA can reduce the inflammation in the hippocampus after diabetes， increase the synaptic related factors and neurotrophic factors in the hippocampus， and thus exert neuroprotective effects.
　　[Key words] Oleoylethanolamine; Diabetic brain damage; Hippocampus; Neuroprotection
　　 2型糖尿病（T2DM）是最常見的内分泌疾病之一，患者血糖控制不足，常出现继发性并发症，继发视网膜病变、肾病、心肌病和脑病等多系统损害。糖尿病脑病（DE）或糖尿病相关认知功能减退（DACD），是糖尿病患者中枢神经系统中的一系列神经化学、神经生理和结构异常，其中包括糖尿病后引发的认知功能障碍、脑信号传导异常、神经传递和突触可塑性变化以及底层结构改变[1]。虽然糖尿病学习记忆障碍的多因素发病机制尚不完全清楚，但涉及到晚期糖基化终产物（AGEs）的形成和Tau蛋白过磷酸化[2]等因素，都是阿尔茨海默病（AD）的主要病理标志物，因此也有很多人将AD作为2型糖尿病脑病进行研究。
　　 神经元丢失是学习记忆能力的结构性缺陷，在突触紊乱、信号障碍、神经递质障碍和认知功能障碍中起着重要作用，由高血糖引起的海马依赖空间记忆损伤与神经元损伤的恢复，甚至是丢失都存在着重要关系，已有大量研究数据表明慢性神经元丢失是糖尿病与AD联系的关键机制[3]。因此，可推测具有神经保护能力的药物对糖尿病认知缺陷的治疗是具有一定积极作用的。过氧物酶体增殖物激活受体α（PPARα）在中枢神经系统中发挥重要作用，如能量代谢、神经传递、维持氧化还原内稳态、自噬等。最近研究显示PPARα受体激动剂具有抑制β淀粉样沉积、Tau蛋白过度磷酸化和神经炎症作用[4]。然而，PPARα通路对糖尿病脑病的作用尚未在糖尿病小鼠进行测试。 　　 油酰乙醇胺（OEA）是一个有力的内源性PPARα激动剂，前期研究表明，长期OEA治疗对大鼠脑缺血损伤具有认知功能恢复和神经保护作用，另一方面， OEA可通过G蛋白偶联受体（GPR） 119的激活有效抑制高血糖。最近的研究表明，OEA类似物丙二酸-2-磺酸-9-烯酰酰胺（N15）在高脂饮食（HFD）和链脲佐菌素（STZ）诱导的T2DM小鼠中发挥降糖作用[5]。在过去的研究中显示OEA治疗可以抑制缺血性中风诱导的细胞炎症以及具有调控神经营养因子的作用，而这些作用均由PPARα信号介导[6]。因此，在该研究中，探讨了OEA对HFD+STZ诱导的糖尿病小鼠海马内炎症因子以及神经营养因子的影响，为研究OEA对糖尿病后认知障碍的影响提供理论依据，现报道如下。
　　1  材料与方法
　　1.1  药品
　　 油酰乙醇胺（OEA）（厦门大学手性重点实验室合成提供）。
　　1.2  实验动物
　　 （25±2）g SPF级C57BL/6J雄性小鼠，合格证号为SCXK（京）2016-0041，常规啮齿类动物饲料喂养。
　　1.3  动物实验
　　 50只上述雄性C57BL/6J小鼠适应性喂养1周后，随机分为5组，每组10只，除正常组外，其余给予高脂高糖饲料喂养6周造模，空腹血糖≥11.1 mmol/L为成功，将小鼠随机分成3组，即模型组、OEA低、中、高剂量治疗组，正常组和模型组小鼠分别给予含1%吐温80的生理盐水0.2 mL/（kg·d）腹腔注射，其余小鼠随机分为OEA低、中、高剂量治疗组，分别给予OEA 15、30和60 mg/（kg·d）腹腔注射，连续给药6周。
　　1.4  Real time-PCR法检测
　　 给药6周后，按照荧光定量PCR检测试剂盒说明书进行实验，操作在冰上进行，PCR结束后得到扩增曲线和 Ct值。
　　1.5  Western blot法检测
　　给药6周后，BCA试剂盒蛋白定量，蛋白通过SDS-PAGE电泳，并通过湿转转移到PVDF膜，使用Image Station 4000 R的扫描光密度测定法将蛋白质带可视化和定量。
　　1.6  统计方法
　　 采用 Graphpad Prism7.0 软件进行数据处理分析，实验结果以（x±s）表示，进行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2  结果
　　2.1  糖尿病脑病小鼠海马内炎症因子IL-6、IL-1β和TNFα的表达水平
　　 在给予不同浓度OEA注射给药6周后，通过Real time-PCR以及western blot对小鼠海马内IL-6、IL-1β和TNFα的mRNA以及蛋白表达量进行测定。如图1所示，与Normal组相比，DM组小鼠海马内IL-6和IL-1β mRNA以及TNFα的蛋白表达量均明显增加（P<0.01），在分别给予15、30、60 mg/（kg·d）OEA治疗后，小鼠海马内IL-6和IL-1β mRNA下调，差异有统计学意义（P<0.05），海马内TNFα蛋白表达量也明显降低，因此可以推测OEA可降低II型糖尿病海马内炎症因子IL-6、IL-1β和TNFα的表达。
　　2.2  糖尿病脑病小鼠海马内GAP43、SYN、BDNF和NT3 mRNA表达
　　 在给予不同浓度OEA注射给药6周后，通过Real time-PCR测定，如图2所示，与正常组相比，模型组小鼠双侧海马内GAP43和SYN的mRNA明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），小鼠海马内GAP43和SYN mRNA增加，差异有统计学意义（P<0.05），即OEA可对糖尿病后小鼠海马突触可塑性进行调节;同时，小鼠海马内NT3和BDNF的mRNA明显增加，因此可以推测OEA可明显提高2型糖尿病后小鼠海马内神经营养因子BDNF和NT3的表达。
　　3  讨论
　　 OEA是一种内源性 PPAR-α激动剂，在脂质代谢，改善脑供血和增加神经功能方面具有多种作用，并且有这方面的报道，而对糖尿病脑部损害的研究未见报道，脑部炎性因子的表达过度可以损害脑功能，炎性因子表达在脑卒中、脑外伤等脑部损害中明显增加，神经相关因子表达下降直接损害脑功能，所以炎性因子和神经相关因子在糖尿病脑损害中的表达如何，OEA是否可以降低炎性因子的表达，提高神经相关因子的表达，以改善糖尿病的腦损害，为预防和治疗提供新的途径。
　　 已有大量实验资料表明，体内IL-6的异常与多种脑部疾病相关，TNFα是一种典型的促炎细胞因子，其在启动先天免疫系统的炎症反应中起重要作用，部分通过诱导其他细胞因子的表达和释放，通过该次的研究发现脑内IL-6、IL-1β和TNF-α表达糖尿病组明显升高，经过OEA治疗后明显下降，即说明OEA可以抑制脑内炎症因子的表达，从而发挥抗炎作用。
　　 海马区域的神经营养和神经可塑性对许多神经系统相关疾病的致病和治疗因素敏感。神经可塑性是指大脑在一生中适应、改变和重组的能力，突触可塑性是认知功能的重要方面。为了更好地理解OEA对改善T2DM后认知障碍的作用，该次评估了慢性OEA治疗对神经可塑性以及突触可塑性的影响。GAP-43是一种神经特异性轴突蛋白，在神经突生长调控、生长锥引导和突触可塑性等方面发挥重要作用。SYN是突触前泡蛋白，在突触发生和突触功能中具有神经保护作用，通常反映突触数量和密度。该次的数据显示糖尿病小鼠海马区的GAP-43和SYN水平显著下降。这表明这些变化可能与糖尿病后的认知缺陷和神经元丢失有关。然而，OEA处理显著增加了GAP-43和SYN的表达，说明OEA可能通过增强突触可塑性来改善糖尿病引起的认知障碍。该次的数据证实糖尿病小鼠海马中BNDF和NT3水平下降，而OEA处理显著提高了BNDF和NT3的水平。这种靶向的改善海马神经营养和神经可塑性可能是降低DE风险和改善DE结果的潜在策略。 　　 綜上所述，结果显示OEA具有抑制糖尿病后海马内炎症因子分泌，调节神经可塑性的作用，而这些作用与糖尿病脑病的进程和发展息息相关，因此推测OEA是一种具有减轻糖尿病引起的认知功能缺陷的潜力的神经保护制剂，可用于糖尿病脑病药物的研究。
　　[参考文献]
　　[1]  Bhutada P，Mundhada Y，Bansod K，et al.Protection of cholinergic and antioxidant system contributes to the effect of berberine ameliorating memory dysfunction in rat model of streptozotocin-induced diabetes[J].Behavioural brain research，2011，220（1）：30-41.
　　[2]  Aulston BD，Schapansky J，Huang Y，et al.Secreted amyloid precursor protein alpha activates neuronal insulin receptors and prevents diabetes-induced encephalopathy[J].Experimental neurology，2018（303）：29-37.
　　[3]  Pugazhenthi S，Qin L，Reddy PH.Common neurodegenerative pathways in obesity， diabetes， and Alzheimer's disease[J].Biochimica et biophysica acta，2017，1863（5）：1037-1045.
　　[4]  D'Orio B，Fracassi A，Ceru MP，et al.PPARalpha in Alzheimers disease[J].Curr.Alzheimer Res，2018（15）：345-354.
　　[5]  Ren T，Yang WS，Lin Y，et al.A novel PPARalpha/gamma agonist， propane-2-sulfonic acid octadec-9-enyl-amide， ameliorates insulin resistance and gluconeogenesis in vivo and vitro[J].European journal of pharmacology，2018（826）：1-8.
　　[6]  Zhou H，Yang WS，Li Y，et al.Oleoylethanolamide attenuates apoptosis by inhibiting the TLR4/NF-kappaB and ERK1/2 signaling pathways in mice with acute ischemic stroke[J].Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology，2017，390（1）：77-84.
　　（收稿日期：2019-10-12）
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