基于网络药理学的酒炖白芷药效作用机制研究

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　　【摘 要】 目的：通过网络药理学研究酒炖白芷的活性成分、作用靶点、相关信号通路和疾病的关联性，揭示酒炖白芷药效的作用机制。方法：选取酒炖白芷中27个活性成分，依据反向药效团匹配（PharmMapper）方法预测活性成分作用靶点，进而构建活性成分-作用靶点、疾病-作用靶点-通路网络，进行GO富集和KEGG通路富集分析，研究酒炖白芷的作用机制。结果：根据疾病-作用靶点-通路网络分析，涉及偏头痛的关键靶点为ESR1、IL-2和NOS3;涉及鼻炎的关键靶点为EGFR和MAPK8;涉及癫痫的关键靶点为GSTA1、GSTP1和GSTM1。GO富集条目1316 个，其中生物过程相关的条目1172个，分子功能相关的条目48个，细胞组成相关的条目96个。KEGG 通路117条，主要涉及hsa04024、hsa04022、hsa04151、hsa04370、hsa04014等通路。结论：酒炖白芷的药效作用机制体现了中药多成分-多靶点-多通路的特点，本研究为酒炖白芷炮制机理、药效作用的深入研究及都梁丸的临床应用提供科学依据。
　　【关键词】 网络药理学;酒炖白芷;偏头痛;鼻炎;癫痫
　　【中图分类号】R285.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2020）2-0025-06
　　Abstract：Objective To study the active ingredient， action target， related signal pathway and disease correlation of wine - processed products of Angelicae dahurica Radix and reveal the action mechanism of the effect of wine - processed Products of Angelicae dahurica Radix based on network pharmacology.Methods 27 active components of wine - processed products of Angelicae dahurica Radix were selected to predict the targets of action by reverse pharmacophore matching method， and then the active componenttarget and disease targetpathway network was constructed. GO enrichment and KEGG pathway enrichment analysis were carried out to study the action mechanism and processing mechanism of Angelica dahurica Radix.Results According to the analysis of disease-targetpathway network， the key targets involved in migraine are ESR1， IL-2 and NOS3， the key targets involved in rhinitis are EGFR and MAPK8 and the key targets involved in epilepsy are GSTA1， GSTP1 and GSTM1. There are 1316 GO enrichment entries， of which 1172 are related to biological processes， 48 are related to molecular function， and 96 are related to cell composition. There are 117 KEGG pathways， mainly involving hsa04024， hsa04022， hsa04151， hsa04370， hsa04014 and other pathways.Conclusion The pharmacodynamic mechanism of wine-processed products of Angelicae dahurica Radix reflects the characteristics of multi componentsmulti targetsmulti pathways of traditional Chinese medicine. This study provides a scientific basis for the further study of the processing mechanism， efficacy and he clinical application of Duliang pills provide scientific basis of Angelica dahurica with yellow rice wine stewing.
　　Keywords：Network pharmacology;Angelica dahurica with yellow rice wine stewing;Migraine;Rhinitis;Epilepsy
　　白芷藥用历史悠久，具有解表散寒、祛风止痛、宣通鼻窍等功效，其古代记载有酒浸、酒蒸、酒炒、醋制、盐水炒等多种炮制方法，但现代很少应用。酒炖白芷主要用于2015版《中国药典》一部收载的成方制剂“都梁丸”中，制备方法为取白芷饮片，加入黄酒（每100kg白芷加入黄酒20kg），经闷润、隔水蒸制后干燥制得。酒炖白芷由于黄酒成分的引入及受热炮制作用可使其化学成分及药效作用与白芷存在差异，前期化学成分研究中发现酒炖白芷中含有与白芷基本相同的化学成分，只是含量有所差异[1-2]，但引入的黄酒的成分，由于技术限制尚需进一步研究。目前，白芷在抗偏头痛、治疗鼻炎、抗癫痫等[3]药理作用方面报道较多，但白芷经黄酒炮制制成酒炖白芷后，是否对其药效产生影响或具有增强药效作用及都梁丸中为何采用酒炖白芷而不采用白芷入药，还需结合药效作用机制进一步深入研究。因此，为增加酒炖白芷炮制品在抗偏头痛、治疗鼻炎、抗癫痫等疾病方面的应用，笔者拟以黄酒与白芷中所含的主要化学成分作为酒炖白芷中可能含有的活性成分为筛选对象，采用网络药理学的方法，着重探讨酒炖白芷在抗偏头痛、治疗鼻炎、抗癫痫的药效作用机制，并综合分析活性成分靶点、相关生物信号通路与疾病的关联性，为酒炖白芷炮制机理、药效作用机制的深入研究及其在临床应用提供科学依据。 　　1 材料
　　ChembioDraw Ultra软件（Version 13.0）、Cytoscape软件（Version 3.6.1）、R软件、UniProt数据库（https：//www.uniprot.org）、GeneCards数据库（https：//www.genecards.org）、DrugBank数据库（https：//www.drugbank.ca）、NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）、String数据库（https：//string-db.org）、TCMSP数据库（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）、PharmMapper Serve数据库（http：//59.78.96.61/pharmmapper）。
　　2 方法
　　2.1 酒炖白芷活性成分的筛选 酒炖白芷为白芷经辅料黄酒炮制制得，其所含主要的化学成分可能主要源于白芷与黄酒中的成分。通过TCMSP数据库获取白芷的化学成分，以类药性（DL）≥0.18和口服生物利用度（OB）≥30%为筛选条件，选取DL≥0.18和OB≥30%的化学成分作为白芷的潜在药效成分。由于酒炖白芷经辅料黄酒炮制，经对黄酒的活性成分进行文献的挖掘与整理，同时列为酒炖白芷的活性成分。
　　2.2 作用靶点的获取 采用ChembioDraw Ultra软件绘制活性成分三维结构图，以SYBYL2（*.mol2）格式保存，并通过PubChem和TCMSP数据库进行结构验证，将活性成分的SYBYL2（*.mol2）格式文件上传到PharmMapper Serve数据库中获取靶点信息，再将该数据库中Uniplot一栏上传到UniProt数据库中并将限定选为人，将靶点名称校正为官方名称。
　　2.3 疾病相关靶点的筛选 在GeneCards、DrugBank和NCBI数据库中输入migraine（cephalagra、hemicrania、antimigraine）、rhinitis（nasitis）和epilepsia（epilepsy、hieronosus）搜索文献已报道的与偏头痛、鼻炎和癫痫相关的基因，去除重复的和假阳性基因，与上述PharmMapper Serve数据库获得的靶点进行对比分析，得到活性成分中的抗偏头痛、鼻炎以及癫痫的潜在作用靶点。
　　2.4 通路富集与分析 将通用蛋白编号（Uniprot ID）导入R软件中，对所有蛋白的编码基因进行GO注释分析和KEGG通路分析，计算各通路P值并预测相关靶点蛋白参与表达的生物学通路（P<0.05），采用Cytoscape软件构建酒炖白芷的靶点通路网络图。
　　2.5 网络构建 将酒炖白芷的活性成分、作用靶点、相关疾病、通路导入Cytoscape软件中，构建活性成分-作用靶点、疾病-作用靶点-通路网络，以探究酒炖白芷在抗偏头痛、鼻炎以及癫痫方面的药效作用机制。
　　3 结果
　　3.1 酒炖白芷活性成分的筛选 从TCMSP数据库中获得223个白芷化学成分，以DL≥0.18和OB≥30%为筛选条件，结合文献报道，共获取17个活性成分。依据文献报道，结合黄酒中化学成分的性质，选取含量高、无挥发性、耐热性的10个成分作为黄酒的主要活性成分，将筛选出的白芷中的17个成分与黄酒中的10个成分，即共27個成分为酒炖白芷主要活性成分，结果见表1。
　　3.2 靶点预测 将表1中27个活性成分在PharmMapper Serve数据库中返回的潜在作用靶点按匹配度（Fit）降序排列，各取前25个靶点，除去重复项后得到144个基因靶点，通过GeneCards、DrugBank和NCBI数据库与相关基因进行对比，筛选与抗偏头痛、鼻炎和癫痫相关联的可能潜在作用靶点，分别为60个、51个、17个，表2列举Degree值排名前10的靶点蛋白。
　　3.3 活性成分-作用靶点网络图的构建和分析 构建的酒炖白芷活性成分-作用靶点网络图（图1），图中共有171个节点，678条线，红色菱形节点代表酒炖白芷的活性成分（外围是白芷的活性成分，内环是黄酒的活性成分），绿色圆形节点代表作用靶点，灰色细线代表活性成分与作用靶点间相互关联。表明酒炖白芷的药效作用具有多成分、多靶点的特点。
　　3.4 通路富集与分析 采用R软件对酒炖白芷靶点蛋白进行KEGG通路富集，共富集134条，其中P值<0.05的有117条，部分通路信息（见图2）。表明酒炖白芷主要通过环磷酸腺苷、环磷酸鸟苷-依赖性蛋白激酶、T细胞受体、Ras、MAPK、雌激素、PI3K/Akt、VEGF和Mtore等9条信号通路发挥抗偏头痛、鼻炎、癫痫的药效作用;GO注释分析表明在生物过程中这些靶点主要涉及蛋白质磷酸化、肽基酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修饰;在分子功能中主要涉及蛋白酪氨酸激酶活性、激酶调节活性、RAS鸟苷酸交换因子活性、鸟苷酸交换因子活性等方面;在细胞组成中主要涉及膜质侧、膜筏、膜微区、膜区等方面，GO注释分析信息见图3。图4为靶点-通路-疾病图，其中红点为疾病，蓝点为通路，黄点为靶点。
　　4 讨论
　　研究结果表明，酒炖白芷主要通过环磷酸腺苷（cAMP）、环磷酸鸟苷-依赖性蛋白激酶（cGMP-PKG）、MAPK信号通路发挥抗偏头痛药效作用。同时在调控MAPK信号通路发挥抗偏头痛中，酒炖白芷共富集22个靶点，而生白芷为15个;酒炖白芷主要通过调控环腺苷-磷酸、T细胞受体和Ras信号通路发挥抗偏头痛作用，与生白芷相比，酒炖白芷在各个通路富集靶点多，并比生白芷多了雌激素、cGMP-PKG两条信号通路。有研究表明NO被认为是引起原发性偏头痛的触发物，可舒张平滑肌，扩张脑内血管，进而增加痛觉的传导，导致中枢敏化[4]。脑血管神经末梢内含有NOS，在NOS催化下，L-精氨酸产生NO，通过与G蛋白偶联的膜受体结合激活可溶性鸟苷酸环化酶，从而使细胞内鸟苷酸（cGMP）水平升高。NO并可诱导三叉神经节细胞合成和分泌CGRP，CGRP是目前最强血管扩张药物，对脑、心血管最为明显。CGRP通过平行的信号通路，增加腺苷酸环化酶和环磷酸腺苷（cAMP）的产生[5]。对抗CGRP和NO信号的化合物、CGRP拮抗剂和NO合成酶抑制剂均可减轻偏头痛。另外，MAPK是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，MAPK家族主要包括细胞外调节蛋白激酶 （ERK） 、c-Jun氨基末端激酶 （JNK） 和p38丝裂原活化蛋白激酶 （p38MAPK），分别介导3条并行的MAPK信号通路[6]。TNF-α和IL-6等炎性因子可通过上调p-ERK1/2、p-p38及p-JNK的表达，激活MAPK通路，进而在细胞的增殖、凋亡、炎症及免疫等多方面发挥关键的作用[7-9]。因此，推测酒炖白芷可能通过调控cAMP信号通路和cGMP-PKG信号通路，降低CGRP和NO的产生和分泌，并通过阻断MAPK通路，减少炎症因子的释放，发挥抗偏头痛的作用。 　　研究发现酒炖白芷抗鼻炎的作用可能与PI3K/Akt、VEGF通路有关，PI3K/Akt通路是VEGF诱导内皮细胞存活和迁移的重要信号分子，ERK通路也涉及细胞存活和迁移的调节[10]，P13K、Akt和ERK1/2的磷酸化水平与VEGR的产生具有一致的趋势。血管内皮生长因子（VEGF）和MMP-9在促进鼻黏膜组织肿胀与腺体分泌亢进过程中发挥重要作用。VEGF可能是MMP-9高表达的诱导因素[11]，可促进血管增生及通透性，参与鼻腔黏膜肿胀及腺体分泌亢进过程。酒炖白芷可能通过抑制PI3K/Akt通路和ERK通路，可以显著降低VEGF的产生，下调MMP-9的表达发挥抗鼻炎的作用。另外，酒炖白芷还可能通过调控P13K/AKt和ERK1/2信号通路发挥抗癫痫作用。在癫痫发生过程中，短期内即可促使信号通路被激活表达p-ERK1/2，通过调节ERK1/2信号通路，可对癫痫发作产生拮抗作用[12];其中PI3K/AKt信号通路是调节神经细胞各项活动的重要通路之一，广泛参与神经元细胞的生存、分化、凋亡等过程，当P13K/AKt通路被抑制时，可以有效抑制海马神经元凋亡[13]。mTOR为P13K/AKt途径的下游丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，mTOR抑制剂可以有效预防癫痫发作[14]。在调控P13K/AKt信号通路发挥抗鼻炎和癫痫作用中，酒炖白芷共富集29个靶点，而生白芷为22个，且比白芷多1个治疗鼻炎的VEGF信号通路。酒炖白芷在mTOR信号通路共富集10个靶点，而生白芷为7个。
　　在靶点预测分析中发现，酒炖白芷中ESR1、IL-2和NOS3等与偏头痛相关的靶点度值、EGFR和MAPK8等与鼻炎相关的靶点度值、GSTP1、GSTA1和GSTM1等与癫痫相关的靶点度值，均高于生白芷中相关靶点度值。
　　综上所述，白芷酒炖后与偏头痛、鼻炎和癫痫相关的靶点、通路均多于白芷，且靶点度值增大，可能主要与黄酒成分的引入及水合氧化前胡素含量增加[2，15，16]等因素有关，其药效作用机制体现了中药多成分-多靶点-多通路的特点，为酒炖白芷“酒制升提”或“引药上行”的炮制机制的深入研究提供了新思路。但其对药效作用的改变或药效作用的增强还需进一步通过体内药效实验进行验证。
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　　（收稿日期：2019-10-24 编辑：陶希睿）
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