注射用盐酸溴己新原料中细菌内毒素的检测
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作者:林金海 陈晓佳 丁友玲
摘 要 目的：建立注射用盐酸溴己新原料中细菌内毒素的检测方法。方法：对盐酸溴己新原料预处理后再进行细菌内毒素检测，并依据《中华人民共和国药典》2015年版细菌内毒素检查法中的干扰实验对预处理方法进行验证。结果：预处理并稀释160倍后的盐酸溴己新原料对鲎试剂（λ=0.06 EU/ml）无干扰作用。结论：所建立的注射用盐酸溴己新原料中细菌内毒素检测方法是可行的。
关键词 细菌内毒素 盐酸溴己新 干扰实验
中图分类号：R927.12； R974.1 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2020）07-0075-03
Study on the bacterial endotoxin test in the raw material of bromhexine hydrochloride for injection*
LIN Jinhai， CHEN Xiaojia， DING Youling**
（Fuzhou Xinbei Biochemical Industrial Co.， Ltd.， Fuzhou 350101， China）
ABSTRACT Objective： To establish a method for the bacterial endotoxin test in the raw material of bromhexine hydrochloride for injection. Methods： The raw material of bromhexine hydrochloride for injection was pretreated and then bacterial endotoxin test was performed. The method was verified based on the interference experiment in the bacterial endotoxin test section of Chinese Pharmacopoeia 2015 Edition. Results： There was no interference on tachypleus amebocyte lysate （λ=0.06 EU/ml）after it was pretreated and diluted by 160 times. Conclusion： The established method can be used for the bacterial endotoxin test in the raw material of bromhexine hydrochloride for injection.
KEy WORDS bacterial endotoxin； bromhexine hydrochloride； interference experiment
细菌内毒素检查法要求实验样品溶液pH控制在6～8[1]。盐酸溴己新（bromhexine hydrochloride）在乙醇中微溶，在水中极微溶解[2]。乙醇助溶后的盐酸溴己新溶液（1 mg/ml）pH<4，为了检测盐酸溴己新原料中的细菌内毒素，笔者采用加碱性调节剂（pH=7.8的TrisHCl缓冲溶液）调节pH至7.5左右，再稀释至160倍，使之适用于细菌内毒素检查法。根据《中华人民共和国药典》四部通则“1143细菌内毒素检查法”中“干扰实验”的要求，对本预处理进行了验证。
1 材料及仪器
1.1 材料和试剂
鲎试剂（TAL）（批号：18051312，规格：0.1 ml/支，标示灵敏度：0.06 EU/ml），细菌内毒素检查用水（批号：18033121，规格：100 ml/瓶），pH调节剂（碱性）（批号：180301，pH为7.8～8.2，规格：2 ml/支），以上试剂均为福州新北生化工业有限公司生产。
细菌内毒素国家标准品（中国食品药品检定研究院，批号：150800-201601，规格：1 ml/支，效价：9 000 EU/支）。无水乙醇（西陇科学股份有限公司，批号：17120102，分析纯）。注射用盐酸溴己新原料（江西亿友药业有限公司，细菌内毒素限值<10 EU/mg）。
1.2 仪器
FA2204B电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；XMTD-7000电热恒温水温箱（上海科恒实业发展有限公司）；ZH-2混合器（天津药典标准仪器厂）。
2 方法与结果
2.1 预实验
2.1.1 鱟试剂灵敏度（λ）的复核
依照《中华人民共和国药典》四部通则1143“细菌内毒素检查法”，对选用的鲎试剂进行灵敏度复核试验，实测灵敏度（λc）=antilg（∑X/4），式中X为反应终点浓度的对数值（lg），结果见表1。
由表1可见，鲎试剂（批号：18051312）的实测灵敏度（λc）为0.06 EU/ml，符合在0.5～2λ范围内的要求。
2.1.2 盐酸溴己新原料预处理
盐酸溴己新原料于100～105 ℃[3]下干燥5 h，取出置干燥器中降温30 min，获得盐酸溴己新原料干燥品。精密称定盐酸溴己新原料干燥品，加无水乙醇溶解，在漩涡混合器中混合9 min，制成1 mg/ml的盐酸溴己新溶液，即为供试品原液，备用。
2.1.3 盐酸溴己新溶液干扰预实验
供试品阴性对照（NPC）：供试品原液加等体积细菌内毒素检查用水，稀释至2倍，再加入等体积的碱性调节剂（pH=7.8的Tris-HCl缓冲溶液），稀释至4倍。用细菌内毒素检查用水进一步稀释，制成稀释20倍、40倍、80倍、160倍、320倍这5个连续稀释倍数的溶液，作为NPC。 供试品阳性对照（PPC）：在上述5个NPC中加入细菌内毒素标准溶液，使每个均含有2λ的细菌内毒素，作为PPC。
阳性对照（PC）：细菌内毒素浓度为0.125 EU/ml的细菌内毒素检查用水。
阴性对照（NC）：细菌内毒素检查用水。
选用鲎试剂（批号：18051312，λ=0.06 EU/ml）进
行干擾预实验，结果见表2。
由表2可见，1 mg/ml的盐酸溴己新溶液稀释≥80倍时，对细菌内毒素检查实验无干扰。为了有效避免干扰，本研究选用供试品原液稀释160倍进行干扰实验。
2.2 盐酸溴己新溶液干扰实验
取供试品原液（1 mg/ml）按干扰预实验处理方法稀释160倍，选用鲎试剂（批号18051312，λ=0.06 EU/ml），依据《中华人民共和国药典》四部通则“1143细菌内毒素检查法”进行干扰实验，结果见表3。
由表3可见，Es/Et在0.5～2.0间，表明1 mg/ml盐酸溴己新乙醇溶液按预实验处理（稀释160倍）对鲎试剂（λ=0.06 EU/ml）无干扰作用。
2.3 注射用盐酸溴己新原料的细菌内毒素检查
1 mg/ml的盐酸溴己新乙醇溶液调节pH后，用细菌内毒素检查用水稀释160倍。按照《中华人民共和国药典》四部通则1143“细菌内毒素检查法”进行细菌内毒素检查（鲎试剂λ=0.06 EU/ml）。实验结果为：阳性对照、供试品阳性对照均为阳性；阴性对照、供试品阴性对照均为阴性。说明该批次注射用盐酸溴己新原料（细菌内毒素限值<10 EU/mg）稀释160倍，选用鲎试剂（λ=0.06 EU/ml）进行细菌内毒素检查，原料细菌内毒素含量符合要求。
3 结论
《中华人民共和国药典》中“细菌内毒素检查法”代替兔法已应用于500多种药品或原料药细菌内毒素的检测。但是，对某些注射用药品及原料在进行细菌内毒素检查时，需要排除干扰因素，以适应用鲎试剂检测细菌内毒素时所需的基本条件[4]。往往在样品检测前需加入二价阳离子调节剂、碱性或酸性调节剂，或者采用稀释法来消除样品对鲎试剂的干扰[5-9]。由于注射用盐酸溴己新原料是难溶物质，本研究采用乙醇溶解盐酸溴己新原料，再加碱性调节剂（pH=7.8的Tris-HCl缓冲溶液）调节pH的预处理方法，再根据它的内毒素限值选用鲎试剂（λ=0.06 EU/ml）、稀释倍数160倍，证明对检测盐酸溴己新原料中的细菌内毒素实验无干扰。
参考文献
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