抗体药物偶联物的研究进展

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　　 【摘要】 抗体-药物偶联物的分子由单克隆抗体、连接子和小分子毒素三部分组成，这三部分对抗体-药物偶联物的稳定性、有效性及安全性均起到非常关键的作用。本文对抗体-药物偶联物的抗体靶标选择、连接子设计、载带药物的选择及抗体偶联位点研究作一综述，并且对已上市和处于临床后期阶段的抗体-药物偶联物做了总结分析。
　　 【关键词】 单克隆抗体 连接子 载带药物 抗体-药物偶联物
　　 doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.12.078 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2020）12-0-04
　　 Research Progress of Antibody Drug Conjugates/YAO Xuejing. //Chinese and Foreign Medical Research， 2020， 18（12）： -188
　　 [Abstract] The molecule of antibody drug conjugates （ADCs） is composed of three parts： monoclonal antibody， linker and small molecule toxin. These three parts play a key role in the stability， efficacy， and safety of antibody drug conjugates. In this paper， the selection of antibody targets， the design of linker， the selection of drug carriers and the study of antibody conjugation sites of antibody drug conjugates were reviewed. In addition， the antibody drug conjugates which had been on the market and in the late clinical stage were summarized and analyzed.
　　 [Key words] Monoclonal antibody Linker Drug carriers Antibody drug conjugates
　　 First-author’s address： RemeGen， Ltd. Yantai， Yantai 264006， China
　　 抗体-药物偶联（antibody drug conjugates，ADCs）作为新型生物导弹药物概念的提出已有30多年，近几年随着美国FDA批准了多个ADC药物上市，ADC药物的研发成为空前热点[1]。ADC是将肿瘤杀伤力强的小分子毒素药物（payload）与单克隆抗体通过连接子（linker）偶联[2]，形成的偶联物能利用单克隆抗体的靶向性，特异性地识别肿瘤细胞表面的抗原，然后经过细胞的内吞进入到细胞内部，利用细胞内的蛋白酶释放细胞毒物，杀死肿瘤细胞，以达到提高药效、增大“治疗窗”的目的。因此，对于可成药的ADC药物，应该具备三个特点：单克隆抗体具有高度的靶标特异性，小分子药物具有高效的细胞毒效力，连接子在体循环中能保持较好的稳定性。
　　1 ADC药物的靶标选择
　　 ADC药物抗体部分的理想特性包括：（1）具有最小化的免疫原性;（2）与靶抗原具有足够的特异性及结合亲和力，并可实现有效的内化;（3）具有较长的循环半衰期[3]。在特异性方面，一个理想的靶标抗原需要同时具备两个特性：（1）在靶细胞表面表达，但在健康组织中低表达[4]。（2）在血液循环系统中脱落应该尽可能地少，以防止游离的抗原在循环中与抗体结合[5]。
　　 目前国内外处于临床研究的ADC靶标很多，主要分为针对血液癌的靶标和针对实体瘤的靶标。其中，针对血液癌的靶标主要有CD19、CD22、CD30、CD33、CD37、CD74、CD79b、CD138、BCMA等，针对实体瘤的靶标主要有HER2、Nectin4、Trop-2、FOLR1、DLL3、gpNMB、PSMA、EGFR、Mesothelin、ENPP3、Mucin16、CA6、CEACAM5、STEAP1、CD56等[6]。
　　2 载带药物
　　 对于ADC来说，细胞毒素的选择是至关重要的。用于偶聯的细胞毒素必须作用机制清楚、分子量小、活性高，并且不具有免疫原性，采用化学方法偶联到抗体上后仍能保留抗肿瘤活性。某些细胞毒素如长春花碱和甲氨蝶呤偶联到抗体上后几乎失去抗癌能力[7]。目前，用于ADC的细胞毒素，根据作用机制不同主要分为DNA损伤剂和微管蛋白抑制剂。DNA损伤剂主要包括卡奇霉素（Calicheamicins，CLM）、阿霉素（Doxorubicin）、Duocarmycins、PBDs（Pyrrolobenzodiazepines）等，微管蛋白抑制剂主要包括美登素（Maytansines）和奥利司他汀（Auristatins）。
　　 卡奇霉素是天然的烯二炔类抗肿抗生素，最早从土壤微生物中分离提取获得。卡奇霉素和DNA结合后，产生自由基，切割DNA骨架，达到杀伤肿瘤细胞的效果。在卡奇霉素衍生物中，Calicheamicin γ的生物活性最高。第一个上市的ADC药物Mylotarg，是将Calicheamicin γ连接到抗CD33的单抗上，用于治疗急性髓细胞性白血病[8]。
　　 阿霉素是从放线菌的发酵液中提取的蒽环类抗肿瘤药物，可以抑制DNA的复制及RNA的合成，从而抑制肿瘤细胞的正常分裂。Immunomedics公司的临床药物Milatuzumab Doxorubicin就是采用阿霉素作为细胞毒素偶联到CD74抗体上，用于治疗多发性骨髓瘤等疾病[9]。 　　 Duocarmycins是苯并二吡咯类抗肿瘤抗生素，其衍生物主要有Duocarmycin A、Adozelesin、CC-1065等。Duocarmycins能特异性地识别并烷基化DNA碱基，具有较好的抗肿瘤活性。采用Duocarmycins衍生物CC-1065为细胞毒素偶联至抗体的发明已被报道[10]。
　　 PBD是一类天然的抗肿瘤抗生素，它可以与DNA共价结合并引起DNA损伤。与抗CD33单抗偶联的ADC药物SGN-CD33A使用了PBD，对白血病具有很好的疗效，目前正在临床研究中[11]。
　　 美登素是从热带非洲的美登木中发现的大环内脂类化合物，可以抑制微管蛋白聚集，进而抑制细胞的有丝分裂，达到抗肿瘤的效果。美登素的衍生物DM1和DM4为含巯基的有丝分裂抑制剂，已用于构建ADC药物。
　　 奥利司他汀是海洋生物环肽的衍生物，其抗肿瘤的作用机制是通过抑制分裂细胞的纺锤体形成，使分裂停止于有丝分裂中期。用于和抗体偶联的auristatins衍生物主要包括MMAE和MMAF。
　　3 连接子
　　 在ADC的研究中，连接子的构建是关键点之一。首先连接子须具备一定的稳定性，在未达到肿瘤细胞之前，能确保ADC在血液循环过程中的完整性;另外，在进入靶细胞后，连接子要确保“弹头”细胞毒素的有效释放。连接子从性能上可分为不可裂解连接子和可裂解连接子。
　　 不可裂解连接子在血液循环系统和肿瘤细胞内均可保持稳定，比如硫醚连接子、酰胺类连接子。基因泰克公司研发的ADC药物Kadcyla是通过稳定的硫醚连接子将DM1连接到抗体上[12]。
　　 可裂解连接子根据裂解机理不同分为：化学裂解连接子和酶裂解连接子。化学裂解连接子基于血液和细胞质的环境（pH，氧化还原能力等）不同而发生裂解，主要包括pH敏感型连接子和二硫键连接子。腙类连接子是一种pH敏感的化学裂解连接子，在血液中性环境（pH 7.3～7.5）下稳定，而进入细胞后，由于pH偏酸性会发生断裂释放细胞毒药物。Trail等[13]通过腙类连接子将阿霉素和单抗BR96偶联，当该ADC药物进入肿瘤细胞后可有效地将细胞毒素释放。但由于腙类连接子选择性相对较低，在血液循环过程中会释放一定的细胞毒素，从而导致半衰期短、安全性降低，因而临床实验未获预期。二硫键连接子是另一种常用的化学裂解连接子，二硫键是热力学稳定的，其断裂取决于细胞内谷胱甘肽的浓度。这种还原型谷胱甘肽在血液中的浓度是微摩尔级，但由于肿瘤细胞内呈缺氧状态，还原性酶活性增强易将二硫键打开，释放出细胞毒素。
　　 肽连接子是目前使用最广泛的酶裂解连接子，已批准上市的ADC药物Adcetris通过缬氨酸-瓜氨酸（Valine-Citrulline）二肽连接子把微管抑制剂MMAE偶联到单克隆抗体cAC10[14]。这种连接子在血循环中具有高度稳定性，而肿瘤细胞内高度表达的溶酶体蛋白酶B，可将连接子的两个酰胺键酶解，细胞毒素就以完整的活性形式释放出来。这种连接子的优势是既保持了ADC药物在血循环中的稳定性，又可使细胞毒药物在肿瘤部位快速释放，同时药物以活性结构释放而不带有任何的附加修饰，较好的保持了药物分子的理化特性和活性。
　　4 ADC药物的偶联策略
　　 抗体和细胞毒素的偶联方式对ADC的生物学活性、耐受性及药物稳定性有重要影响[15]。如果偶联的细胞毒素过少，则会降低其生物活性;过多则增加ADC在血液中的清除率及安全性风险，同时影响抗原和抗体的有效结合。通常而言，理想的药物偶联数目为2～4。目前进入临床应用的偶联方式有两种，分别是赖氨酸的氨基（-NH2）偶联，半胱氨酸的巯基（-SH）偶联。随着基因重组抗体技术的发展，定点氨基酸偶联也代表了一定的发展趋势，通过在抗体蛋白中引入一个含-SH的突变氨基酸或具有活性官能团的非天然氨基酸而实现定点偶联[16]。
　　4.1 赖氨酸的氨基偶联
　　 多数抗体富含活泼的赖氨酸，因此赖氨酸的氨基偶联是最常见的偶联方式之一，已批准上市的Mylotarg和Kadcyla采用的就是氨基偶联方式。但赖氨酸偶联有可能改变抗体自身的电荷数量，影响抗体的稳定性，所以该种偶联方式，细胞毒素不宜过多。
　　4.2 半胱氨酸的巯基偶联
　　 大部分的单克隆抗体属于IgG，链内、链间二硫键多达16对，但4对链间二硫键相对较易断裂。通过选择性较高的还原剂（如TCEP）及优化的还原条件和配比，二硫键容易被选择性还原生成活性较高的自由巰基，且对抗体蛋白的结构不产生太大的影响。自由巯基可与马来酰亚胺等物质发生反应，反应条件比较温和，并且产率高。因为抗体二硫键的个数要远少于赖氨酸的个数并且位置相对确定，所以半胱氨酸的巯基偶联有较好的均一性。
　　4.3 定点偶联
　　 通过基因工程手段在抗体分子中引入具有活性基团的氨基酸，从而通过氨基或巯基的化学偶联载带上毒素，这样可以实现对于ADC偶联率及产品均一性的有效控制。另外对于定点巯基偶联，因不断裂抗体天然的二硫键，从而明显改善ADC的体内半衰期。
　　 巯基抗体偶联（THIOMAB drug conjugates，TDC）：该技术是通过定点突变引入额外的半胱氨酸残基从而实现通过巯基的定点偶联[17]。例如，将MC-VC-PAB-MMAE偶联到anti-MUC16抗体（重链A114C）中形成TDC。随着工艺的成熟，偶联率DAR能达到接近2.0，平均每个抗体含2个毒物分子。该半胱氨酸定点偶联的方法已被西雅图基因公司用于研发SGN-CD33A，偶联产物中约有95%的抗体连有2个药物，该药物已进入临床研究[1]。
　　 通过谷氨酰胺转移酶进行定点偶联：利用谷氨酰胺转移酶将含氨基的药物偶联到经改造的谷氨酰胺上[18]。该偶联策略为在抗体上进行改造引入谷氨酰胺，然后将PEG官能化的小分子毒物偶联到抗体的谷胺酰胺上，形成定点偶联。 　　 抗體非天然氨基酸的偶联：通过在IgG中引入β-乙酰苯丙氨酸作为非天然氨基酸，含有天然氨基酸中不含有的酮官能团。酮官能团与烷氧基胺间可形成肟键，该键在生理条件下非常稳定。因此，利用短的聚乙二醇连接子将醇胺连到auristatin F的衍生物上，形成连接子-毒素。与T-DM1类似，该药物含有不可裂解的连接子，药物的释放取决于抗体在溶酶体的降解[19]。定点偶联的ADCs看似要优于非定点偶联的ADCs，但是该结论只是基于有限的临床前数据，还需要大量的临床数据来验证。此外，定点偶联的ADCs仍在研发的初期阶段，仍需进行很多改进，如增加偶联物的均一性，提高承载药物的数量等。
　　5 FDA已经批准上市或处于临床后期阶段的ADC药物
　　 目前处于临床研究的ADC药物有100多个，FDA已经批准上市的ADC药物有7个，其中Polatuzumab vedotin-piiq、Enfortumab vedotin、Trastuzumab deruxtecan 三个药物是在2019年批准的，另外有许多ADC药物处于Ⅲ期临床研究阶段，见表1。
　　 随着生物技术的不断进步，抗体和毒素的偶联技术在更新换代，ADC的靶点、连接头及载带毒素的选择也在逐步改善。同时，随着免疫疗法的发展，开发ADC联合治疗的选择也越来越多。因此，相信在不远的未来，ADC有望被更多地应用于肿瘤患者的治疗。
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　　（收稿日期：2019-12-30） （本文編辑：桑茹南）
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